ICS65.020.30 B43 团体标准 T/SDAA0045－2021 2021－11－30发布 2021－12－31实施 山东省畜牧协会发布多杀性巴氏杆菌的检测PCR法 DetectionofPasteurellamultocidabyPCR 全国团体标准信息平台 T/SDAA0045－2021 全国团体标准信息平台 T/SDAA0045－2021 前  言 本文件按照GB/T1.1—2020的规定起草。 本文件由山东省畜牧协会提出并归口。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件起草单位：青岛农业大学、青岛农业大学海都学院、山东省动物疫病预防与控制中心。 本文件主要起草人：韩先杰、邱慧玲、兰邹然、陈甫、高善颂、宋春阳、张廷荣、于光辉、于忠娜。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 T/SDAA0045－2021 全国团体标准信息平台 T/SDAA0045－2021 多杀性巴氏杆菌的检测PCR法 1范围 本文件规定了猪多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法。 本方法适用于猪多杀性巴氏杆菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T564-2016猪巴氏杆菌病诊断技术 3原理 根据多杀性巴氏杆菌的基因序列设计一对特异性引物，以多杀性巴氏杆菌的DNA核酸 为模板，扩增特异的目的DNA片段。扩增的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳，根据DNA条带 的大小来判断结果。 4试剂或材料 除非另有规定，所用试剂均为分析纯。 4.1水：GB/T6682，一级。 4.25%绵羊鲜血平板 4.3革兰氏染液 4.42×TaqMasterMix 4.5DNAMarkerDL2000 4.6琼脂糖 4.7TAE缓冲液 4.84SGreenPlus无毒核酸染料 全国团体标准信息平台 T/SDAA0045－2021 5仪器设备 5.1生物安全柜：配ULPA超高效空气过滤器。 5.2高速冷冻离心机：转速不低于12000rpm/min。 5.3PCR仪：最大升降温速率为4℃/秒，温度范围4℃~99℃。 5.4凝胶成像仪：图像分辨率不低于500万像素，灵敏性可检测出低于20pgEB染色的双链 DNA。 5.5紫外透射仪：透射紫外光源波长为302nm。 5.6电泳仪，恒压输出范围：3～300V、恒流输出范围：1～400mA、恒功率输出范围：1～ 120W。 6样品 按照NY/T541的规定采集、贮存样品。 7试验步骤 7.1细菌的分离及纯培养 7.1.1在生物安全柜内，将无菌采取的患病动物心血用接种环直接在绵羊鲜血平板上划线接 种。对采集的肺脏、肝脏或脾脏，用酒精灯火焰烧红的刀片烧烙肺脏、肝脏或脾脏的表面， 用无菌手术剪刀在烧烙部位剪开一个小口。酒精灯火焰灼烧接种环，冷却后将接种环从病料 的小口处扎入肺脏等内部，挑取少量组织，在5%绵羊鲜血平板上划线接种。接种后的平板 贴好标签后放入恒温箱，37℃培养24h，观察菌落大小、形态、溶血状况等。 7.1.2猪多杀巴氏杆菌的菌落为圆形、边缘整齐、表面光滑似粘液状、大小为1mm~1.5mm 左右，菌落形态参见附录A.1。 7.2革兰氏染色与镜检 7.2.1取洁净的载玻片，用接种环钩取一环无菌生理盐水在载玻片上涂布呈直径1cm大小的 水膜。挑取单个菌落均匀涂抹在水膜内，室温干燥、火焰固定。进行革兰氏染色。 7.2.2滴加结晶紫染色液，染色1min~2min，流水缓慢冲洗，干燥； 7.2.3滴加革兰氏碘液，染色1min~2min，流水缓慢冲洗，干燥； 7.2.4滴加95%的乙醇，脱色10s~30s，流水缓慢冲洗，干燥； 全国团体标准信息平台 T/SDAA0045－2021 7.2.5滴加复染液，复染1min，流水缓慢冲洗，自然干燥。 7.2.6镜检 猪多杀巴氏杆菌为革兰氏染色阴性、短小杆菌或球杆菌，细菌形态参见附录A.2。 7.3PCR检测 7.3.1细菌基因组DNA模板的制备 按照NY/T564-2016中4.4.4中的规定制备。 7.3.2PCR扩增 7.3.2.1引物 根据多杀巴氏杆菌16SrRNA基因序列（见附录A.3），设计一对引物，商业合成，引 物序列见附录B.1。 7.3.2.2PCR反应体系 PCR反应体系为25µL体系，见附录B.2。 7.3.2.3PCR反应条件 样品反应管以2000rpm/min离心1min，置于PCR扩增仪内进行扩增。PCR反应条件为： 94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，扩增32个循环，72℃终延 伸10min，结束反应。同时设置多杀巴氏杆菌阳性（标准株）和阴性（无菌水）对照。PCR 扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，紫外透射仪或凝胶成像仪观察扩增DNA条带的大 小。 7.4PCR产物琼脂糖凝胶电泳 按NY/T564-20164.4.6规定执行。 7.5结果判定 7.5.1试验成立的条件 参照DL2000DNAMarker中DNA条带的大小，当阳性对照扩增出约355bp片段，阴性对照 未扩增出片段，检测结果成立，核酸电泳结果见附录B.3。 7.5.2阳性判定 符合7.5.1的条件下，被检样品扩增出约355bp的片段，则判定被检细菌为多杀性巴氏 杆菌。 全国团体标准信息平台 T/SDAA0045－2021 7.5.3阴性判定 符合7.5.1的条件下，被检样品未扩增出约355bp的片段，则判定被检细菌不是多杀性 巴氏杆菌。 附录A （资料性） A.1多杀性巴氏杆菌的菌落形态（图A.1） A.2猪多杀性巴氏杆菌形态（图A.2）图A.1猪多杀巴氏杆菌菌落形态（绵羊鲜血平板） 图A.2猪多杀巴氏杆菌形态（革兰氏染色） 全国团体标准信息平台 T/SDAA0045－2021 A.3靶基因片段及引物在靶基因中的位置（图A.3） TAATACTTGGGAATCTGGCTTATGGAGGGGGATAACTGTGGGAAACTGCAGCTAATACCG CGTATTCTCTGAGGAGGAAAGGGTGGGACCTTAGGGCCACCTGCCATAAGATGAGCCCAA GTGGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGCCTGCGATCTCTAGCTGGTCTG AGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA G AGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA G CCTTCGGGTTGTAAAGTTCTTTCGGTAATGAGGAAGGGATGTTGTTAAATAGATAGCATC ATTGACGTTAATTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG GAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATAACTGGGCGTAAAGGGCACGCAGGCGAACTTTTAA G 图A.3设计引物的参照序列 附录B （规范性） B.1PCR扩增的引物序列（表B.1） 引物名称 引物序列（5＇-3＇方向） 扩增片段大小 上游引物（F）TATGGAGGGGGATAACTGTG355bp下游引物（R）GTCGTTAACGTCAATGATGC B.2PCR扩增体系（表B.2） 组分 体积（μL） 2×TaqMasterMix 12.5 上游引物 1.0 下游引物 1.0 DNA模板 1.0 无菌H2O 9.5下游引物上游引物 全国团体标准信息平台 T/SDAA0045－2021 B.3PCR检测多杀巴氏杆菌核酸电泳结果（图B.3） 全国团体标准信息平台