ICS 11.020 C 51 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB45/T 2138—2020 水体中诺如病毒的核酸检测方法 实时荧光 RT-PCR 法 Detection of norovirus nucleotide acid in water— Real-time RT-PCR 2020 - 07 - 24 发布 广西壮族自治区市场监督管理局 2020 - 08 - 20 实施 发 布 — DB45/T 2138 2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区卫生健康委员会提出并宣贯。 本标准由广西壮族自治区卫生技术标准委员会归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：刘巍、邓丽丽、谭冬梅、马宇燕、钟革、李秀桂。 Ⅰ 水体中诺如病毒的核酸检测方法 实时荧光 RT-PCR 法 1 范围 本标准规定了水体中诺如病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于广西区域内地表水、地下水、集中式供水、娱乐用水、污水等水体中基因Ⅰ组和基因 Ⅱ组诺如病毒的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 诺如病毒 Norovirus 世界范围内引起急性胃肠炎暴发和散发的重要病原体。大多数诺如病毒引起的水源性暴发疫情是由 于饮用水或生活用水被污染所致。诺如病毒属于人类杯状病毒科的诺如病毒属，是一组形态相似、抗原 性略有不同的病毒颗粒。诺如病毒直径 26 nm～35 nm，无包膜，表面粗糙，球形，呈二十面体对称。诺 如病毒基因组是单股正链 RNA，全长 7.5 kb～7.7 kb，根据基因特征，诺如病毒被分为 6 个基因组 （genogroup，ＧⅠ～ＧⅣ），ＧⅠ和ＧⅡ是引起人类急性胃肠炎的两个主要基因组，ＧⅣ也可感染人， 但很少被检出。 2.2 实时荧光逆转录-聚合酶链式反应 Real-time RT-PCR 在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值对模 板进行定性。 2.3 Ct 值 Cycle threshold value 每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。各模板的Ct值与该模板的起始拷贝 数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。反之亦然。 3 原理 水样在通过带负离子混合纤维素膜时，带正离子的病毒被吸附到膜上，然后再洗脱病毒，并用聚乙 二醇沉淀病毒达到富集浓缩的效果。应用实时荧光RT-PCR技术，针对诺如病毒衣壳蛋白区N/S区设计特 异性引物和探针，荧光探针的5’端标记报告荧光基团，3’端标记淬灭荧光基团，当探针完整时，报告 荧光基团的发射波长被淬灭荧光基团的激发波长吸收；当PCR扩增时，Taq酶的5’→3’端外切酶活性将 探针酶切水解，报告荧光不再受淬灭荧光的影响，使荧光监测系统收集到报告基团的荧光信号，即每扩 增一条DNA链，可产生一个报告基团的荧光信号，实现荧光信号积累与PCR产物形成同步。 4 试剂和耗材 4.1 试剂 4.1.1 除另有说明外，本文件所使用的试剂均为分析纯，分子生物学试剂所用水为无 RNA 酶的水。 1 — DB45/T 2038 2020 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6 4.1.7 2.5 mol/L 氯化镁（MgCl2）溶液，配制遵照附录 A 中的 A.1 执行。 3％牛肉浸膏洗脱液，配制遵照附录 A 中的 A.2 执行。 16％PEG8000 溶液，配制遵照附录 A 中的 A.3 执行。 0.2 mol/L 的 Na2HPO4 溶液，配制遵照附录 A 中的 A.4 执行。 1 mol/L 盐酸溶液、1 mol/L 氢氧化钠溶液、RNA 提取试剂盒、实时荧光 RT-PCR 试剂盒。 引物和探针。工作浓度均为 10 μmol/L， -20 ℃保存，引物和探针序列见表 1。 表1 实时荧光引物和探针序列表 基因组 GⅠ GⅡ 引物/探针 序列 JJV1F (上游引物) 5'-GCCATGTTCCGITGGATG-3' JJV1R (下游引物) 5'-TCCTTAGACGCCATCATCAT-3' JJV1P (探针) 5'-FAM-TGTGGACAGGAGATCGCAATCTC-BHQ-3' JJV2F (上游引物) 5'-CAAGAGTCAATGTTTAGGTGGATGAG-3' COG2R (下游引物) 5'-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3' RING2 (探针) 5'-FAM-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-BHQ-3' 4.2 耗材 包括以下物品： ——混合硝酸纤维素膜，孔径 0.45 μm； ——快速定性滤纸； ——离心管，1.5 mL、50 mL； ——0.2 mL 透明薄壁 PCR 管。 5 仪器设备 包括以下物品： ——电子天平，精度≥0.01 g； ——高速台式冷冻离心机，可控温至 4 ℃，离心速度≥13 000 g； ——水过滤装置； ——正压力泵； ——振荡混匀器； ——高压灭菌器； ——实时荧光 PCR 扩增仪； ——二级生物安全柜。 6 检测流程 见图1。 2 — DB45/T 2138 2020 1 L 水样+过程控制病毒+氯化镁溶液 过滤 剪碎滤膜+牛肉浸膏洗脱液 振荡洗脱 20～30 min 上清液+PEG8000 溶液 4 ℃静置 2～3 h 4 ℃，10 000 g 离心 5 min 沉淀+200 μL Na HPO 剧烈振荡 5 min 至重悬沉淀 4 ℃，10 000 g 离心 5 min，取上清 病毒浓缩液 2 4 病毒 RNA 提取 实时荧光 RT-PCR 图1 水体中诺如病毒的核酸检测流程 7 水样前处理 7.1 水样运送与保存 运输过程中保持水样温度在0 ℃～5 ℃。实验室接到水样后应48 h内进行检测。如未及时检测，应 将水样置于-80 ℃冰柜保存待检。 7.2 病毒富集浓缩 滤装置 剪刀 镊子 高压灭菌备 L l L 氯化镁溶液 再 l L L 样 掺 μL 商品化 离 盐酸调节 样 H 至 ± 混浊度较 杂质较 样,需 先将 样 4 ℃ i 取上清 装 滤装置 与 压力泵连接 启动 压力泵 使 样缓慢 孔 4 μ 混合 硝酸纤维素 浊度较 杂质较 样 增 层快速 滤纸 混合硝酸纤维素 上 然 镊子将硝酸纤维素 取 剪碎成边 c 小 块 放 先装 L ％牛肉膏洗脱液 L离 及 小玻璃珠 i 取上清液转移至干净 L离 振荡混匀器振荡 i ％ E 8 溶液 振荡充 混匀 调节 H 至 4 ℃ 静置 h h 离 i 弃上清 将 L 离 溶液 部倾倒 干净 滤纸上 4℃ μL μL l L a H O 振荡 至完 悬沉淀 离 i 取上清即 浓缩液 4℃ 7.2.1 水过 、 、 等 用。 的过程控制病毒，加入 20 m 的 2.5 mo / ， 用 1 mo / 7.2.2 1 水 中 入 10 、3 500 g 心 水 p 3.0 0.5。如为 大或 多的水 预 水 于 。 30 m n， 7.2.3 组 水过 ，并 正 。 正 ， 水 通过 径为 0. 5 m 的 膜，如为 大或 多的水 ，可 加一 定性 于 膜 ， 有 10 m 的 3 后用 膜 出， 长 0.5 m 的 方 ， 入预 心管中。 2颗 的 50 m 的 50 m 心管中。 7.2.4 用 20 m n～30 m n， 2 ～3 。 7.2.5 加入等体积的 16 P G 000 ， 分 ， p 值 7.0， 、10 000 g 心 5 m n， 后， 50 m 心管中的 全 在 的 。 7.2.6 ～200 的 0.2 mo / N 2 P 4， ，直 全重 。 7.2.7 加 100 、10 000 g 心 5 m n， 为病毒 。 7.2.8 3 — DB45/T 2038 2020 8 实时荧光 RT-PCR 检测 8.1 病毒 RNA 提取 使用病毒 RNA 提取试剂盒进行 RNA 的提取，可根据仪器和试剂盒要求调整操作步骤。以诺如病 毒阳性的粪便悬液样本或商品化的诺如病毒样本为核酸提取过程阳性对照，以双蒸水作为核酸提取过程 阴性对照。 8.1.2 将病毒浓缩液加入预先装有 560 μL 裂解液的 1.5 mL 离心管中，混匀，室温放置 10 min，再加 入 560 μL 无水乙醇，混匀。 8.1.3 取 650 μL 混合液加入到纯化柱上，8 000 g 离心 1 min 弃收集管中的离心液。 8.1.4 将 1.5 mL 离心管中剩余的混合液全部加入到纯化柱的上，8 000 g 离心 1 min，弃离心液。 8.1.5 于纯化柱上加入 510 μL 洗液 1，8 000 g 离心 1 min，弃离心液。 8.1.6 于纯化柱上加入 510 μL 洗液 2，13 000 g 离心 1 min，弃离心液。 8.1.7 更换新的收集管，13 000 g 离心 1 min。 8.1.8 将纯化柱放置到干净的 1.5 mL 离心管上，向柱中心加入 35 μL RNA 洗脱液，室温放置 5 min。 8.1.9 8 000 g 离心 1 min，离心管收集到的液体即为 RNA。 8.1.10 所用实验用具及溶液应无 RNA 酶，操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套。提取后的 RNA 如无法立即检测，应放在-80 ℃冰箱保存待检。 8.1.1 8.2 提取效率计算 以水样中过程控制病毒 RNA 的提取效率表示水样中诺如病毒 RNA 的提取效率，作为病毒富集浓 缩及病毒 RNA 提取的过程控制。 8.2.2 过程控制病毒按试剂盒说明书提取 RNA 后，进行 10 倍梯度稀释至 10 或 10 。 8.2.3 每个稀释度分别取 5 μL 加入到含有检测过程控制病毒的引物和探针的反应体系中，采用与检 测诺如病毒相同的实时荧光 RT-PCR 反应参数，进行实时荧光 RT-PCR 反应，确定未稀释和梯度稀释过程 控制病毒 RNA 的 Ct 值。 8.2.4 以未稀释和梯度稀释过程控制病毒 RNA 的浓度 lg 值为 X 轴，以其 Ct 值为 Y 轴，建立标准曲线； 标准曲线 r ≥0.98。未稀释过程控制病毒 RNA 浓度为 1，梯度稀释过程控制 RNA 浓度分别为 10 、10 、 10 、10 等。 8.2.5 将掺有过程控制病毒的水样 RNA，加入到含有检测过程控制病毒引物和探针的反应体系中，采 用与检测诺如病毒相同的实时荧光 RT-PCR 反应参数，进行实时荧光 RT-PCR 反应，确定 Ct 值，代入标 准曲线，计