(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110770716.X (22)申请日 2021.07.08 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113476603 A (43)申请公布日 2021.10.08 (73)专利权人 中南大学 地址 410083 湖南省长 沙市岳麓区麓山 南 路932号 (72)发明人 彭逸舟　段金娣　杨艳婧　钟世安　 (74)专利代理 机构 长沙市融智专利事务所(普 通合伙) 43114 专利代理师 袁靖 (51)Int.Cl. A61K 41/00(2020.01) A61K 9/51(2006.01) A61K 47/46(2006.01) A61K 47/60(2017.01) A61K 47/10(2006.01) A61K 47/12(2006.01) A61K 47/24(2006.01)A61K 47/22(2006.01) A61K 47/26(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 49/00(2006.01) (56)对比文件 CN 104637644 A,2015.0 5.20 WO 201417075 5 A2,2014.10.23 彭逸舟， 等.基 于RBC-OCS-Fe3O4磁性纳米粒 子自组装与磁控制癌细胞运动的研究. 《科技 风》 .2020,第280页. 袁罡.聚乙二醇化F e3O4作为 光热治疗剂对 大鼠C6胶质瘤细胞光热治 疗的可行性研究. 《中 国优秀博硕士学位 论文全文数据库(博士)医药 卫生科技辑》 .2015,(第08 期),第E072-4页. Sonia García-Jimeno,et al. .Ferrofluid based on polyethylene glyco l-coated iro n oxide nan oparticles:C haracterizati on and properties. 《Co lloids and Surfaces A: Physicoc hemical and Engi neering Aspects》 .2012,第420卷 审查员 张素芳 (54)发明名称 一种红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒及其制 备方法和应用 (57)摘要 本发明涉及一种红细胞膜包裹的磁性纳米 颗粒及其制备方法和应用， 具体为水热法制备的 PEG‑Fe3O4用经靶向修饰的红细胞膜碎片挤出包 裹， 制备出有免疫逃避性和灵敏磁 响应性的纳米 颗粒红细胞膜 ‑PEG‑Fe3O4， 能靶向吸附对叶酸敏 感的癌细胞， 方便其被磁场控制或通过光热刺激 杀灭癌细胞。 红细胞膜 ‑PEG‑Fe3O4可有效靶向吸 附到叶酸敏感的癌细胞膜上， 赋予癌磁响应性， 有利于磁场控制运动和用光热刺激杀灭。 因此在 靶向治疗和产业推广方面具有潜在的应用前 景。 权利要求书1页 说明书9页 附图15页 CN 113476603 B 2022.05.20 CN 113476603 B 1.一种红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： （1） PEG‑Fe3O4的制备； （2） 红细胞膜 碎片的提取和靶向修饰； （3） 红细 胞膜‑PEG‑Fe3O4的制备： 将PEG ‑Fe3O4加入由PEG6000 ‑10000与油酸钠加入超纯 水配成的分散液， 超声， 静置， 去沉淀取上层悬浮液， 步骤 （2） 获得的靶向修饰的红细胞膜与 上层悬浮液共混搅拌， 再放入脂质体挤出器， 经多次挤出获得； 步骤 （2） 红细胞膜碎片的提取过程： 将抗凝哺乳动物血离心沉淀红细胞去上清， 用冰 PBS洗涤， 再用低渗溶液浸泡破碎剩下的红细胞， 离心,  留沉淀去上清， 冰PBS洗涤沉淀， 反 复多次， 直到沉淀变成淡粉色或白色， 红细胞膜和牛黄胆酸钠溶液按照牛黄胆酸钠： 红细胞 膜=1： 6或1:4质量比混合， 溶入4 ‑6倍体积乙醇， 超声混匀后装入注射器， 迅速注入40 ‑45℃  8‑12倍乙醇溶 液体积的PBS溶 液, 50‑70℃旋蒸15 ‑25min； 步骤 （3） PEG6 000‑10000与油酸钠的质量比为1:2 ‑2： 1， 加入 超纯水配成6‑8%分散液。 2.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 步骤 （3） P EG6000‑10000与油酸钠的质量比为1： 1， 加入超纯水配成6%分散液； PE G‑Fe3O4 在分散液中的浓度为10 0‑300µg/mL。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 超声采用超声细胞破碎仪， 功 率为600‑1000W， 频率为15‑25kHz。 4.根据权利 要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中将步骤 （2） 获得的靶向修饰 的红细胞膜与上层悬浮液共混搅拌， 加热至 38‑45℃， 再进行挤出。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中每毫升PEG ‑Fe3O4与靶向修 饰的红细胞膜的混合溶 液中两者比例15 0‑250µg:3mg。 6.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中用脂质体挤出器从800  nm、 400 nm相继挤出， 40 ‑45℃在20 0 nm膜下挤出3 ‑7次。 7.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 步骤 （1） PEG ‑Fe3O4的制备的具体过程： FeCl2与FeCl3以1： 1.5‑1： 2摩尔比例加入蒸馏水， 再加入FeCl2质量2‑4倍的PEG6000 ‑10000， 超声5 ‑10 min至溶解， 超声采用超声细胞破碎 仪， 功率为600 ‑1000W， 频率为15 ‑25kHz； 置于惰性气氛下以1400 ‑2600 r/min搅拌， 升温至 45‑60℃， 反应30 ‑40 min； 再追加FeCl2质量2‑4倍的PEG6000溶液， 将反应液转移至聚四氟 乙烯反应釜， 设置温度为160 ‑200℃， 反应5 ‑10小时； 得到Fe3O4纳米颗粒沉淀， 先用纯水和乙 醇洗涤沉淀， 重复多次， 真空烘 箱中45‑60℃干燥10 ‑24小时， 最终 获得PEG‑Fe3O4纳米颗粒。 8.根据权利要求1所述的制备 方法， 其特 征在于， 步骤 （2） 红细胞膜碎片的靶向修饰过程： DSPE ‑PEG与靶向分子， 按照摩尔比=1.5 ‑1:1在 PBS溶液中混合形成DSPE ‑PEG‑靶向分子， 靶向分子包括叶酸和甘露醇中的至少一种； 用PBS 溶液稀释过的极少量红细胞膜加 入DSPE‑PEG‑靶向分子， 摇床混合； 红细胞膜与DSPE ‑PEG‑ 靶向分子的质量比为 4:1‑10： 1。 9.一种权利要求1 ‑8任一项所述制备 方法得到的红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒。 10.权利要求9所述的红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒在制备靶向材 料中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113476603 B 2一种红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒 及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于纳 米生物医药材料领域， 涉及 一种红细胞膜包裹的磁性纳 米颗粒的制 备方法及其产品和应用。 背景技术 [0002]癌症是威胁人类生命的一种重大疾病， 常规化疗放疗和手术治疗效果有限， 且副 作用较高， 应癌症市场要求 急需新技术的开 发。 靶向磁纳米颗粒是当前一项研究重点， 磁性 Fe3O4具有独特的磁 性质和导热能力， 有良好的生物相容性， 在癌症 治疗中得到广泛关注， 可 以以少量红外光能量就激发出大量热量， 是光热疗法的好材料， 且其磁性能有利于赋予癌 细胞磁响应性， 便于磁场控制。 Fe3O4的缺点在于磁效应令该粒子容易团聚沉淀， 过大的粒子 不利于人体代谢， 容易累积在肝脏、 肾脏、 淋巴结 处， 造成人体不能容忍的副作用。 虽然目前 现在技术在磁纳米颗粒制备过程中， 通 过Fe3O4的表面修饰， 可以增强其悬浮性， 但是为了达 到减小粒子粒径的目的常采用毒性较大的表面活性剂如十二烷基苯磺酸钠， 有机溶剂四氢 呋喃、 DMSO等， 且常常无法避开免疫细胞的识别 吞噬， 虽然制成的粒子生物效应优异， 但也 存在毒性隐患和被免疫细胞吞噬的风险。 计较表面活性剂与有机溶剂使得选择范围减小， 错选的风险增大， 曾使用过的毒性较低的壳聚糖和海藻酸钠为表面活性剂皆以失败告终。 发明内容 [0003]针对现有技术的不足， 本发明首要 目的在于： 提供一款制 备简易低毒性的且具有 免疫逃避性的靶向纳米粒子制备方 法。 具体为水热法制备的PEG ‑Fe3O4用经靶向修饰的红细 胞膜碎片挤出包裹， 因红细胞膜的隔离作用， 制备出有免疫逃避性和灵敏磁响应性的纳米 颗粒， 由于叶酸靶向分子易得， 对叶酸敏感的癌细胞较多， 将粒子制成能靶向吸附对叶酸敏 感的癌细胞， 方便其被磁场控制或通过光热刺激杀灭癌细胞， 能有效减小粒子粒径除了水 热法， 还使用了PEG6000 ‑10000混合油酸钠制成 的分散剂， 成功将粒子减低至80nm， 红细胞 膜起到去除分散剂后稳定粒径的作用， 整个制备过程有效避开了毒性大的表面活性剂和有 机溶剂。 [0004]一种红细胞膜包裹的磁性纳米颗粒的制备 方法， 包括以下步骤： [0005](1)PEG‑Fe3O4的制备； [0006](2)红细胞膜 碎片的提取和靶向修饰； [0007](3)红细胞膜 ‑P