(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202110971791.2 (22)申请日 2021.08.24 (66)本国优先权数据 202010876 525.7 2020.08.27 CN (71)申请人 盛禾 （中国） 生物制药有限公司 地址 210000 江苏省南京市南京经济技 术 开发区兴 建路5号 (72)发明人 周冲　吴崇兵　王艺臻　姜晓玲　 殷刘松　 (51)Int.Cl. C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/85(2006.01) A61K 39/395(2006.01) A61K 38/20(2006.01)A61K 38/17(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称 一种多功能融合蛋白及其用途 (57)摘要 本发明提供了一种多功能融合蛋白， 具体提 供了一种靶向TAA与CD3， 同时具有 IL‑15/IL‑15R α复合物的生物学效应的多功能融合蛋白。 所述 多功能融合蛋白可解决单靶点抗体药物的耐药 和复发问题， 降低起效剂量， 更加有效地杀伤肿 瘤细胞， 延长IL ‑15/IL‑15Rα血清半衰期并提高 肿瘤靶向性， 降低其毒副作用。 利用CD3抗体与肿 瘤靶向抗体的组合， 可定向肿瘤并招募T细胞接 近肿瘤细胞， 起到介导T细胞杀伤肿瘤细胞的作 用。 通过免疫突触的形成， 抗体功能位点与抗原 之间的相对距离等结构设计， 使该融合蛋白结构 更加稳定。 IL ‑15/IL‑15Rα复合物促进了对T细 胞和NK细胞持久的招募和激活作用。 权利要求书1页 说明书17页 序列表23页 附图8页 CN 114106195 A 2022.03.01 CN 114106195 A 1.一种多功能融合蛋白， 其特征在于， 其包含第一重链、 第二重链和第一轻链、 第二轻 链， 所述第一重链包含特异性结合靶标的VH和 CH1， 细胞因子和其受体， 以及免疫球蛋白Fc 部分； 所述第二重链包含特异 性结合靶 标的VH和CH1， 特异 性结合靶 标的scFv或Fab， 以及免 疫球蛋白Fc 部分； 第一轻链与第一重链， 第二轻链与第二重链分别特异性配对。 2.如权利要求1所述的多功能融合蛋白， 其中所述第 一重链和第二重链包含的VH和CH1 可以特异性结合TAA抗原， 所述TAA抗原为Cl audin18.2、 CA125、 AFP、 CEA、 EGFR、 HER2、 B 7H3、 B7H6、 MUC1、 MUC16、 GPC3、 CD24其中的一种或几种， 优选的， 所述TAA抗原为Claudin18.2或 B7H3。 3.如权利要求1 ‑2任一所述的多功能融合蛋白， 其中所述第一重链包含的细胞因子和 其受体分别为 IL‑15和IL‑15受体。 4.如权利 要求1‑3任一所述的多功能融合蛋白， 其中所述第二重链包含的scFv或Fab可 以特异性激活T细胞、 NK细胞和巨噬细胞， 优选的， 所述第二重链包含的scFv或Fab特异 性靶 向CD3。 5.如权利要求1 ‑4任一所述的多功能融合蛋白， 其中所述第一重链和第二重链的免疫 球蛋白Fc部分选自IgG1、 IgG2、 IgG3、 IgG4的恒定区氨基酸序列， 优选选自IgG1或IgG4的恒 定区氨基酸序列。 6.如权利要求1 ‑5任一所述的多功能融合蛋白， 其中所述第一重链和第二重链的Fc部 分还包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸替换： S228P、 L234F、 L235E、 P331S、 D356K、 T366W、 K392D、 D399K、 Y407A、 和K409D， 优选S2 28P、 T366W和/或Y407A。 7.如权利要求3所述的多功能融合蛋白， 其中所述第 一重链中的IL ‑15与其受体和第二 重链中的scFv或Fab可以分别嵌合于所述第一重链和所述第二重链的Fc部分内部， 也可以 存在于Fc 部分外部， 优选位于所述相应重链的C H1和CH2功能区之间。 8.如权利要求3所述的多功能融合蛋白， 其中所述第一重链中的IL ‑15与其受体、 第二 重链中的scFv或Fab单独或与额外的连接肽一起共价结合于所述链中； 所述连接肽包含甘 氨酸(G)和丝氨酸(S)残基， 优选包 含GGGGS重复， 更优选包 含1‑2个GGGGS重复。 9.如权利 要求3所述的多功能融合 蛋白， 其中所述IL ‑15选自天然的IL ‑15或其变体， 所 述变体包含选自N1D、 N4D、 D30N、 E64Q、 N65D、 N72D、 N79A、 Q108E和N112A的组的一个或多个氨 基酸突变， 优选包含选自N4D、 N65D、 N72D、 N79A和N112A的组的一个或多个氨基酸突变； 所述 IL‑15受体选自I L‑15Rα 或其变 体。 10.如权利要求1 ‑9任一所述的多功能融合蛋白， 其中所述第一重链氨基酸序列选自 SEQ ID NO:1； 所述多功能融合蛋 白的第二重链氨基酸序列选自SEQ  ID NO:2； 所述多功能 融合蛋白的第一轻链和第二轻链的氨基酸序列选自SEQ  ID NO:3。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114106195 A 2一种多功能融合蛋白及其用途 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种多功能融合蛋白， 尤其涉及靶向TAA与 CD3， 同时具有I L‑15/IL‑15Rα 复合物的生物学效应的多功能融合蛋白。 背景技术 [0002]肿瘤的发生和发展都伴随着对免疫系统的入侵， 免疫功能不全的个体常常有较高 的癌症发生率和较差的预后。 细胞因子(cytokine， CK)属于免疫调节分子， 根据其性质、 给 药浓度和活性发挥部位的不同， 对免疫系统具有一定的激活或者抑制作用。 因此给予免疫 刺激性的细胞因子治疗的这种方式， 可以达 到提高癌症患者免疫功能的作用。 [0003]细胞因子作为免疫疗法， 虽然有一定益处， 但在临床上的使用存在着单药给药靶 向性差的缺点， 只有高浓度给药才可以达到抗肿瘤作用， 而高浓度给药会产生免疫抑制作 用和高毒性。 并且， 非靶向性细胞 因子对于免疫系统的激活是系统性的， 免疫系统被广泛的 激活， 具有致命的副作用。 此外， 由于细胞因子属于小分子量蛋白， 不具备抗体的体内循环 保护机制， 单纯的细胞 因子往往半衰期 较短， 需要短时间重复高剂量给药。 目前临床 研究药 物多采用P EG化或者Fc融合来提高细胞因子的半衰期， 虽然半衰期得以延 长， 但仍无法解决 细胞因子的靶向性差的问题。 目前已在多种小鼠肿瘤 模型中验证了NK细胞和T细胞， 尤其是 细胞毒性T细胞在肿瘤免疫过程中的作用。 多个临床试验正在评估某些细胞因子单用， 或者 与多种化疗药物和肿瘤 靶向的单克隆抗体和其他细胞因子联用的抗癌疗效。 但是， 诸如IL ‑ 15等细胞因子存在的高剂量用药下 的毒性以及半衰期短而导致的短时间重复给药问题仍 然存在， 成为联用策略的一大制约因素。 [0004]CD3是由肽链以非共价键组成的复合分子， 在成熟T细胞表面表达， 对阻断急性同 种异体排斥反应起主要作用， 且具有稳定TCR结构和传递活化信号的作用。 针对CD3分子的 单克隆抗体能够激活T细胞增殖及活化， 在其他细胞因子IL ‑15、 IL‑15Rα 等共同作用下， 产 生具有增殖速度快、 杀瘤活性高、 杀瘤谱广及非MHC限制性杀瘤特点的CIK细胞， 对癌症、 慢 性白血病、 肝病及神经性疾病等多种疾病治疗具有显著疗效。 因此利用CD 3抗体与肿瘤 靶向 抗体进行组合， 所构建的双特异性抗体可招募T细胞接近肿瘤细胞， 起到介导T细胞杀伤肿 瘤细胞的作用。 [0005]双特异性抗体在临床上有望成为针对癌症、 自身免疫和传染病 的下一代生物疗 法， 具有单一靶点抗体无法达到的功能。 双特性抗体为细化抗体药物作用机制、 探索 多机制 协同效应提供了 很好的途径。 [0006]专利CN110023336A公开了包含至少三个结合结构域的结合剂， 其中第一结合结构 域与T细胞特异性抗原结合， 并且第二结合结构域和第三结合结构域与密蛋白(Claudin6或 Claudin18.2)结合。 其首次报道了包含密蛋白的两个结合结构域和 靶向T细胞特异性抗原 (例如CD3)的另一个结合结构域的结合剂可诱导强效的T细胞介导的裂解并且在治疗肿瘤 疾病中有效。 而此抗体结构没有细胞 因子的加入， 对T细胞和NK细胞的的激活作用不能达到 很好的效果。说　明　书 1/17 页 3 CN 114106195 A 3