(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110779874.1 (22)申请日 2021.07.09 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113559084 A (43)申请公布日 2021.10.2 9 (73)专利权人 东华大学 地址 201620 上海市松江区松江新城人民 北路2999号 (72)发明人 杨瑞　史向阳　 (74)专利代理 机构 上海泰能知识产权代理事务 所(普通合伙) 3123 3 专利代理师 魏峯 (51)Int.Cl. A61K 9/51(2006.01) A61K 47/46(2006.01)A61K 41/00(2020.01) A61K 33/243(2019.01) A61K 47/54(2017.01) A61K 49/08(2006.01) A61K 49/18(2006.01) A61P 35/00(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 20/00(2011.01) B82Y 25/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) 审查员 耿胜燕 (54)发明名称 一种基于微流控芯片的载药超小四氧化三 铁纳米团簇及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明涉及一种基于微流控芯片的载药超 小四氧化三铁纳米团簇及其制备方法和应用。 该 方法包括： 超小四氧化三铁纳米颗粒制备， 超小 四氧化三铁纳米团簇制备， 4T1细胞膜囊泡悬液 制备， 微流控芯片制备， 细胞膜包覆的载药超小 四氧化三铁纳米团簇制备。 该方法以微流控芯片 为反应器制备的细胞膜包覆的载药超小四氧化 三铁纳米团簇， 生物安全性好， 特异性靶向肿瘤 区域， 选择性递送药物， 实现T2/T1双模态转换的 磁共振成像， 同时实现肿瘤的光热治疗/化学动 力治疗/化疗三模态联合治疗， 在癌症诊疗方面 具有潜在的应用前 景。 权利要求书1页 说明书17页 附图8页 CN 113559084 B 2022.08.26 CN 113559084 B 1.一种基于微 流控芯片的载 药超小四氧化 三铁纳米团簇的制备 方法， 包括： （1） 将铁盐溶于溶剂中， 超声， 加入柠檬酸钠， 搅拌， 再加入无水乙酸钠， 继续搅拌， 然后 溶剂热反应， 冷却， 离心， 干燥， 得到超小四氧化 三铁纳米颗粒 Fe3O4 NPs； （2） 将步骤 （1） 中超小四氧化三铁纳米颗粒Fe3O4 NPs分散在超纯水中， 经EDC和NHS活 化， 然后滴入胱胺二盐酸盐溶 液反应， 透析， 得到超小四氧化 三铁纳米团簇F e3O4 NCs溶液； （3） 将4T1细胞离心， 向得到的4T1细胞沉淀中加入低渗细胞裂解液， 反复冻融破碎， 采 用梯度离心提取4T1细胞膜， 重悬于PBS溶液中， 得到4T1细胞膜悬液， 挤压， 得到4T1细胞膜 囊泡悬液； （4） 设计出包含五个进样口、 一个出样口、 逐渐扩大的S形微流控通道结构， 然后打印出 掩膜版， 再在硅片上光刻制备出模具， 然后倒模， 将得到的微流控通道盖片以载玻片作为基 底， 通过等离子键合， 得到微流控芯片， 其中， 倒模的温度为75~85℃； 等离子键合的工艺参 数为： 真空度为18~22 Pa， 空气中键合处 理时间为70~90 s； （5） 将步骤 （2） 中超小四氧化三铁纳米团簇Fe3O4 NCs溶液与盐酸多巴胺溶液混合， 超 声， 注入到步骤 （4） 中微流控芯片的第一进样口中， 将步骤 （3） 中4T1细胞膜囊泡悬液注入到 步骤 （4） 中微流控芯片的第二进样口中， 将Tr is缓冲液注入到步骤 （4） 中微流控芯片的第三 进样口， 将顺铂水溶液注入到步骤 （4） 中微流控芯片的第四进样口， 所生 成的细胞膜包覆的 载药超小四氧化三铁纳米团簇FDPC通过出样口收集， 其中， 超小四氧化三铁纳米团簇Fe3O4  NCs、 盐酸多巴胺、 4T1细胞膜囊泡和顺铂的质量比为6~8:2~3:0.5~1.5:9~11； 第一进样口、 第二进样口、 第三进样口和第四进样口的流速分别为4~6 mL/h、 0.2~1mL/h、 20~35 mL/h、 8~ 9.5 mL/h。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中铁盐为三氯化铁； 溶剂 为二乙二醇； 铁盐、 溶剂、 柠檬酸钠和无水乙酸钠的比例为0.60~0.66 g : 36~42 mL :  0.46~0.48 g : 1.3~1.4 g。 3. 根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中搅拌为： 空气氛围下 75~85℃搅拌1~3 h； 溶剂热反应温度为180~220℃， 溶剂热反应时间为3~5 h。 4. 根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中超小四氧化三铁纳米 颗粒Fe3O4 NPs、 EDC、 NHS和胱胺二 盐酸盐的质量比为40~60： 196~216： 114~134： 88.5~108.5； 反应温度为室温， 反应时间为2~4天。 5. 根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中EDC和NHS活化为： 先 加入EDC， 搅拌 反应0.5~1.5 h， 再加入NHS， 搅拌 反应2~4 h。 6. 根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 中4T1细胞与低渗细胞 裂解液的比例为107个 : 2~4 mL； 反复冻融破碎的工艺参数为： ‑10~‑30℃快速冷冻， 30~50 ℃快速融化， 重复2~4次； 挤压为： 使用Avanti微型挤出机将4T1细胞膜悬液挤出8~14次； 4T1 细胞膜囊泡悬 液的蛋白浓度为1.8~2.2 mg/mL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113559084 B 2一种基于微流控芯片的载药超 小四氧化三铁纳米团 簇及其制 备方法和应用 技术领域 [0001]本发明属于纳 米医学诊疗材料及其制备和应用领域， 特别涉及 一种基于微流控芯 片的载药超小四氧化 三铁纳米团簇及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]世界卫生组织公布的最新数据显示， 癌症仍是全人类面临的主要致命疾病， 其发 病率和死亡率都呈上升趋势。 但是， 癌症的早期诊断和治疗， 可以极大地提高治愈率。 手术 切除， 放疗和化疗作为 目前癌症的主要治疗手段， 都存在一定的问题。 如手术切除不完全， 患者要面临复发的风险， 并且需要术后长期的临床观察； 放疗和化疗由于缺乏靶向性， 治疗 过程伴随着极大 的副作用。 得益于纳米技术的快速发展， 各种类型 的纳米材料已经开发用 于肿瘤诊疗一体化的研究。 集多种成像和治疗手段于一体的多功 能纳米材料， 有望用于癌 症精确的检测 和治疗， 为实现肿瘤的早期诊疗带来了契机 。 [0003]超小四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒作为一种FDA批准的纳米材料， 具有良好的生物 相容性和T1磁共振成像(MRI)特性。 有趣的是， 当超小四氧化三铁纳米颗粒发生团聚， 进一 步形成较大尺寸的纳米团簇时， 又转变为具备T2磁共振成像性能的造影剂， 因此由超小四 氧化三铁纳米团簇到超小四氧化三铁纳米颗粒的变换， 就 能够实现动态的T2/T1双模态MRI (Liang Jia,et al.Nano Today,2021,36,101022)。 由于肿瘤微环境的谷胱甘肽(GSH)含 量 偏高， 可以利用GS H响应的二硫键将超小四氧化三铁纳米颗粒连接为团簇。 二硫键在高浓度 GSH肿瘤微环境中发生断裂， 团簇重新分散为单一超小四氧化三铁纳米颗粒， 从而既消耗了 肿瘤细胞内的GSH， 使其对活性氧(ROS)敏感， 又实现肿瘤部位的特异性T2/T1双模态磁共振 成像和药物递送。 同时， 在微酸的肿瘤微环境中， 超小四氧化三铁纳米颗粒能够释放出铁离 子， 与肿瘤微环境中H2O2作用， 通过芬顿反应(Fenton)产生活性 氧(ROS)， 实现化 学动力学治 疗(CDT)(K eyi Luo,et al.ACS Appl.Mater.I nterfaces,2020,12,2 2650‑22660)。 [0004]纳米颗粒在肿瘤组织的增强渗透和滞留效应(EPR)可以实现纳 米材料在肿瘤位置 的富集。 但是， 当前用于体内的纳米递送系统依然面临着免疫清除、 蛋白粘附和缺乏靶向性 等问题。 研究表明， 癌细胞膜表面存在免疫逃避蛋白和同源靶向蛋白， 可促进免疫逃逸 (Mingjun  Xuan,et al.Natl.Sci.Rev.,2019,6,551 ‑561)。 为了进一步提 高药物的靶向性 和递送效率， 降低对正常组织和细胞的毒性， 将特定的癌细胞膜包覆在纳米载体表面， 从而 实现肿瘤部位的精准成像和同源 靶向治疗， 在癌症的个性 化治疗领域具有广阔的前 景。 [0005]近年来， 用于癌 症诊疗的纳米材料已经成为研究的热点， 但是， 纳 米材料在临床上 的转化受到了阻碍。 主要原因之一， 就是具有相同性质和足够数量的纳米材料 的可重复合 成仍然存在困难。 微流体技术作为一种高度交叉的科学和技术， 在材料制备方面， 能够 对反 应程序进行精确控制， 并生成具有确定尺寸和形态的纳米材料(Xin  Zhao,et al.Small, 2019,16,1901943)。 由于微流控芯片中反应环境均一， 因此微流体制备的纳米材料的生产 效率和单分散性远高于传统方法。 此外， 通过设计定制微通道，