(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110800583.6 (22)申请日 2021.07.15 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113521097 A (43)申请公布日 2021.10.2 2 (73)专利权人 东华大学 地址 201620 上海市松江区松江新城人民 北路2999号 (72)发明人 沈明武　马文静　高悦　史向阳　 (74)专利代理 机构 上海泰能知识产权代理事务 所(普通合伙) 3123 3 专利代理师 杨琴 (51)Int.Cl. A61K 47/69(2017.01) A61K 48/00(2006.01)A61K 33/26(2006.01) A61K 47/59(2017.01) A61K 47/02(2006.01) A61K 49/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) B82Y 5/00(2011.01) B82Y 20/00(2011.01) B82Y 30/00(2011.01) B82Y 40/00(2011.01) 审查员 李娟娟 (54)发明名称 一种三价铁络合的树状大分子/pDNA复合物 及其制备和应用 (57)摘要 本发明涉及一种三价铁络合的树状大分子/ pDNA复合物及其制备方法和应用。 该复合物为： 表面修饰8 ‑羟基喹啉 ‑2‑羧酸络合三价铁离子、 内部包裹金纳米颗 粒的第五代聚酰胺胺PA MAM树 状大分子负 载p53pDNA。 该方法包括： G5.NH2‑HQC 制备， {(Au0)25‑G5.NH2‑HQC}制备， Fe ‑Au DENP‑ HQC制备， 三价铁络合的树状大分子/pDNA复合物 制备。 该方法操作工艺简单， 反应条件温和， 易于 纯化； 制备得到的复合物具有良好的生物相容 性、 单分散性、 较低的细胞毒 性， 同时具有荧光成 像功能， 可用于肿瘤的铁死亡治疗和基因治疗的 联合治疗， 在诊疗一体化领域具有潜在的应用价 值。 权利要求书1页 说明书13页 附图10页 CN 113521097 B 2022.11.08 CN 113521097 B 1.一种三价铁络合的树状大分子/pDNA复合物， 其特征在于， 所述复合物为： 表面修饰 8‑羟基喹啉 ‑2‑羧酸络合三价铁离子、 内部包裹金纳米颗粒的第五代聚酰胺胺PAMAM树状大 分子负载p53  pDNA， 所述p53  pDNA为具有人体抑癌基因p53和绿色荧光蛋白EGFP基因的质 粒。 2.一种三 价铁络合的树状大分子 /pDNA复合物的制备 方法， 包括： （1） 将8‑羟基喹啉 ‑2‑羧酸HQC溶解于溶剂中， 经EDC和NHS活化， 加入到G5.NH2溶液中， 搅 拌反应， 透析， 冷冻干燥， 得到G5.NH2‑HQC； （2） 将步骤 （1） 中G5.NH2‑HQC溶于超纯水中， 加入HAuCl4·4H2O水溶液， 搅拌， 加入含 NaBH4冰水溶液反应， 透析， 冷冻干燥， 得到{(Au0)25‑G5.NH2‑HQC}， 即Au  DENP‑HQC； （3） 将步骤 （2） 中Au  DENP‑HQC溶于超纯水中， 逐滴加入三价铁盐的水溶液搅拌， 透析， 冷冻干燥， 得到F e‑Au DENP‑HQC； （4） 将步骤 （3） 中Fe ‑Au DENP‑HQC与p53 pDNA共同孵育， 得到Fe ‑Au DENP‑HQC/p53pD NA 复合物， 即三价铁络合的树状大分子/pDNA 复合物， 所述p53  pDNA为具有人体抑癌基因p53 和绿色荧 光蛋白EGFP基因的质粒。 3. 根据权利要 求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中溶剂为DMSO； G5.NH2溶 液的溶剂为超纯水； HQC、 EDC和NHS的摩尔比为1  : 8~10 : 8~10； G5.NH2与HQC的摩尔比为1  :  25~35。 4. 根据权利 要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （1） 中活化时间为2 ‑4 h； 搅 拌反应温度为室温， 搅拌 反应时间为12~48h。 5. 根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中G5.NH2‑HQC与 HAuCl4·4H2O的摩尔比为1  : 20~30HAuCl4·4H2O与NaBH4的摩尔比为1  : 4~1 : 6。 6.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （2） 中搅拌为： 冰水浴条件下 搅拌15~30min； 反应是在冰水浴条件下反应2~3h。 7. 根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 中三价铁盐为FeCl3； Au  DENP‑HQC与三价铁盐的摩尔比为1  : 28~1 : 35。 8.根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （3） 中搅拌温度为室温， 搅拌 时间为2~4h。 9. 根据权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤 （4） 中Fe ‑Au DENP‑HQC与 p53 pDNA的N/P为2  : 1~20 : 1， 其中N/P比为树状大分子的伯胺基与质粒p53骨架上磷酸 基团的摩尔比； 共同孵 育时间为15 ‑30分钟。 10.一种如权利要求1所述的复合物在制备肿瘤的荧光成像和铁死亡/基因联合治疗的 诊疗剂中的应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113521097 B 2一种三价铁络合的树状大分子/pDNA复合物及其制备和应用 技术领域 [0001]本发明属于诊疗一体化功能纳米材料及其制备和应用领域， 特别涉及 一种三价铁 络合的树状大分子 /pDNA复合物及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]癌症是以细胞异常增殖及 转移为特点的一大类疾病， 已成为危害人类健康的主要 疾病之一。 近年来关于如何提高早期恶性肿瘤诊断的准确 性和治疗效果， 特别是如何实现 恶性肿瘤“诊疗一体化 ”方面， 成为了纳米医学研究 的重点和热点。 与此同时， 一些新型的肿 瘤治疗策略如化学动力学治疗/ 铁死亡和基因治疗受到 了人们的广泛关注。 [0003]铁死亡以一种铁依赖性活性氧异常堆积而导致细胞氧化还原稳态失调为特征， 是 区别于细胞凋亡、 细胞坏死、 细胞自噬的一种新型细胞程序性死亡方式， 其主要 特点是铁诱 导的脂质活性氧(ROS)积聚导致细胞发生过氧化反应。 目前， 已有研究证明铁死亡在人类疾 病的治疗中的重要性。 施等人(Huo  M,et al.ACS Nano,2019,13(2):2643 ‑2653)将分散的 铁原子构建到氮掺杂的碳纳米材料中， 制备P EG化的含单原子铁的纳米催化剂， 在酸性肿瘤 微环境下， 肿瘤部位产生大量有毒的羟基 自由基， 同时脂质过氧化物快速积累而引起细胞 凋亡和铁死亡。 另外， 陈的研究小组(Zhou  Z,et al.Angew.Chem.,Int.Ed.,2017,56(23): 6492‑6496)开发了一种基于类芬顿反应的纳米系统， 可以特异性引起肿瘤部位ROS的产生， 进而介导肿瘤铁死 亡和细胞凋亡而诱 导肿瘤细胞死亡。 [0004]基因治疗从本质上来说， 就是通过不 同的手段将外源基因导入靶细胞， 从而达到 治疗疾病的目的。 为实施有效的基因治疗， 安全有效的基因载体是必不可少的。 聚酰胺 ‑胺 (PAMAM)树状大分子是一类具有纳米级尺 寸、 结构大小 可控、 无免疫原性、 性质稳定、 经修饰 后毒性小的超支 化合成大分子， 其表 面具有大量的端基， 可以进 行不同的功能化修饰， 其内 部有空腔可以负载药物或无机纳米颗粒。 另外， 阳离子型PAMAM可通过静电作用有效压缩 带 负电荷的pDNA等基因药物， 用于细胞的基因传递。 例如， 邱等人使用 β ‑环糊精修饰的第五代 PAMAM树状大分子包裹的纳米金颗粒， 可有效压缩和递送VEGF和Bcl ‑2siRNA， 用于相关的癌 细胞基因沉默， 达到癌细胞基因治疗的目的(Qiu  J.et al.Nanomaterials,2018,8(3): 131)。 [0005]检索国内外文献， 目前尚未发现关于络合铁离子的树状大分子纳 米复合物的制备 及其应用于肿瘤荧 光成像和铁死 亡/基因联合治疗的相关报道。 发明内容 [0006]本发明所要解决的技术问题是提供一种三价铁络合的树状大分子/pDNA复合物及 其制备和应用， 以填补现有技 术的空白。 [0007]本发明提供一种三价铁络合的树状大分子/pD NA复合物， 所述复合物为： 表面修饰 8‑羟基喹啉 ‑2‑羧酸络合三价铁离子、 内部包裹金纳米颗粒的第五代聚酰胺胺PAMAM树状大 分子负载p5 3 pDNA。说　明　书 1/13 页 3 CN 113521097 B 3