(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202110810343.4 (22)申请日 2021.07.16 (71)申请人 吉林医药 学院 地址 132013 吉林省吉林市 吉林大街5号 (72)发明人 时念秋　张慧锋　马莹慧　张彦飞　 于欢　郝乘仪　林晓影　赵小萍　 (74)专利代理 机构 吉林新发惠利知识产权代理 事务所(普通 合伙) 22216 代理人 高佳佳 (51)Int.Cl. A61K 47/62(2017.01) A61K 47/69(2017.01) A61K 31/704(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61K 49/00(2006.01) (54)发明名称 一种iNGR/R9双重修饰的阿霉素靶向脂质体 及抗肿瘤活性评价 (57)摘要 本发明是一种iNGR/R9双重功能肽修饰的阿 霉素靶向脂质体， 结构包括盐酸阿霉素脂质体、 肿瘤靶向肽iN GR和细胞穿膜肽R9三部分， 采用迈 克尔加成反应合成了iNGR或R9偶连的PEG ‑DSPE 功能性支链， 采用薄膜分散法 ‑硫酸铵梯度法制 备iNGR/R9双重修饰的盐酸阿霉素靶向脂质体， 具有更好的缓释能力与靶向能力， 增加了盐酸阿 霉素高效进入肿瘤组织细胞并加强了对肿瘤细 胞生长的抑制能力。 iNGR/R9双重功能肽修饰的 阿霉素主动靶向脂质体具有更好的主动靶向性， 能有效的降低盐酸阿霉素对正常组织和细胞造 成的毒性伤害， 降低 副作用。 权利要求书1页 说明书8页 附图6页 CN 114177306 A 2022.03.15 CN 114177306 A 1.一种iNGR/R9双重修饰的阿霉素靶向脂质体， 其特征在于， 结构包括盐酸阿霉素脂质 体、 肿瘤靶向肽iNGR和细胞穿膜肽R9三部分， 采用迈克尔加成反应合 成iNGR/R9偶联的PEG ‑ DSPE功能性支链， 采用薄膜分散 法‑硫酸铵梯度法制备iNGR/R9双重功能肽修饰的盐酸阿霉 素靶向脂质体， 制备 方法： a.按质量比取磷脂： 胆固醇： DSP E‑PEG2000‑iNGR(或DSPE ‑PEG2000‑R9)＝20:5:1溶于氯仿 中， 在45℃下用旋转蒸发仪减压蒸馏40min， 形成脂膜； 加入300mM硫酸铵， 水浴超声水化 30min， 以形成脂质体； 用小型的脂质体挤出机过孔径100nm聚碳酸脂膜挤出20次以控制粒 径， 即可制得i NGR/R9双重肽修饰的空白脂质体， 密封 置于4℃保存备用； b.将R9/iNGR双重肽修饰的空白脂质体过葡聚糖凝胶G ‑50柱： 预先用含有150mM  NaCl 的20mM Hepes(HBS， pH＝7.4)作为洗脱液置换脂质体外部的硫酸铵， 使脂质体内外产生硫 酸铵梯度及 pH梯度； c.按照药脂比(质量比)为1:20精密称取盐酸阿霉素和过柱后的空白脂质体、 混匀， 置 于50℃恒温水浴锅孵 育60min， 即可得到iNGR/R9双重肽修饰的盐酸阿霉素靶向脂质体。 2.根据权利要求1所述的一种iNGR/R9双重肽修饰的阿霉素靶向脂质体， 其特征在于， 所述的肿瘤靶向肽iNGR的制备方法为： 由iNGR和DSPE ‑PEG2000‑MAL使用一步合成法合成： DSPE‑PEG2000‑MAL与半胱氨酸修饰的iNGR(C ‑iNGR)以摩尔比1:1混合溶于Hepes缓冲液中， 反应液在4℃及氮气保护下温和搅拌2 4小时， 反应过程中要避光； 将所得到的反应液置于透 析袋在水中透析48 h， 每2h换一次水， 之后将反应液于 冷冻干燥机中预冻2 4h， 同时顶部扎有 小孔， 再抽干48h即可。 3.根据权利要求2中所述的一种iNGR/R9双重修饰的阿霉素靶向脂质体， 其特征在于， 所述Hepes缓冲液的参数为： pH＝7.2， 20mM  Hepes， 并经 过超声30min除氧处理。 4.根据权利要求1所述的一种i NGR/R9双重修饰的阿霉素靶向脂质体， 其特 征在于， 所述细胞穿透肽R9的制备方法为： 由半胱氨酸修饰的R9(C ‑R9)和DSPE ‑PEG2000‑MAL使用 一步合成法合成： DSPE ‑PEG2000‑MAL与C‑R9以摩尔比1： 1混合， 溶于Hepes缓冲液中； 反应液 在4℃及氮气保护下温和搅拌2 4小时， 反应过程中要避光； 将所得到的反应液置于透析袋在 去离子水中透析48小时， 每2h换一次水， 以除去游离 C‑R9； 反应完成之后透析并冻干即得。 5.根据权利要求3所述的一种iNGR/R9双重修饰的阿霉素靶向脂质体， 其特征在于， 所 述Hepes缓冲液的参数为： pH＝7.2， 20mM  Hepes， 并经过超声30min脱氧， N2流除氧40min处 理。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114177306 A 2一种iNGR/R9双重修饰的阿霉素靶向脂质体及抗肿瘤活性 评价 技术领域 [0001]本发明涉及一种抗肿瘤靶向纳米药物制剂领域， 具体是一种iNGR/R9双重修饰的 阿霉素靶向脂质体及抗肿瘤活性评价。 背景技术 [0002]脂质体有细胞亲和性与组织相容性， 并可长时间吸附于靶细胞周围， 使药物能充 分向靶组织渗透， 脂质体也可通过融合进入细胞内， 经溶酶体消化后使 药物释放于细胞内； 更重要的是脂质体提高了药物的器官靶向性， 能够有效地达到减毒增效的作用。 靶向制剂 能将药物最大限度地输送至并选择性浓集于靶器官、 靶组织、 靶细胞的给药系统， 可达到低 毒高效的治疗效果， 被认为是抗肿瘤的理想剂型。 盐酸阿霉素又名多柔比星， 是临床常用的 蒽环类广谱抗肿瘤药， 抗瘤 谱广、 疗效好， 具有强效的抗癌活性， 但临床 应用毒副作用大， 对 正常组织和 器官产生严重损伤。 主要的毒性反应有： 白细胞和血小板减少； 100％的病人有 不同程度的毛发脱落； 恶心、 食欲减退； 心脏损害、 骨髓抑制、 体重下降等， 治疗指数低， 临床 作用受到限制。 虽然通过减少累积给药剂量可以一定程度上缓解阿霉素类抗肿瘤药物的心 脏毒性， 但同时会降低对肿瘤的控制效果。 [0003]CPPs为细胞穿膜肽， 也叫蛋白传导域， 但由于其缺乏对肿瘤部位的选择性和靶向 性， 需要进一步进行修饰增加导向性。 肿瘤靶向肽(THPs)对受体过表达的靶向细胞系表现 出高特异性和强亲和性。 但THPs不具备组织穿透功能， 主要通过强亲和性以扩散或内吞方 式进入组织及细胞。 美国学者Ruoslahti  E首先提出了一种能穿透肿瘤组织的THPs， 叫 iRGD、 iNGR， 来介导纳米粒子系统及荧 光物质的靶向递送， 用于肿瘤的成像。 [0004]本发明利用具有组织穿透性 的肿瘤靶向穿透肽iNGR和细胞穿膜肽九聚精氨酸R9 共修饰的脂质体为模型， 构建iNGR/R9双重修饰的阿霉素靶向脂质体药物， 以解决现有技术 的阿霉素应用过程中存在的毒副作用大， 对正常组织和器官产生 严重损伤的问题。 发明内容 [0005]本发明的目的在 于提供一种iNGR/ R9双重修饰的阿霉素靶向脂质体及抗肿瘤活性 评价， 以解决上述背景技 术中提出的问题。 [0006]为实现上述目的， 本发明提供如下技 术方案： [0007]一种iNGR/ R9双重修饰的阿霉素靶向脂质体， 结构包括盐酸阿霉素脂质体、 肿瘤靶 向肽iNGR和细胞穿膜肽R9三部分， 采用迈克尔加成反应合 成iNGR或R9偶联的PEG ‑DSPE功能 性支链， 采用薄膜分散法 ‑硫酸铵梯度法制备iNGR/R9双重修饰的盐酸 阿霉素靶向脂质体， 制备方法： [0008]a.按质量比取磷脂： 胆固醇： DSPE ‑PEG2000‑iNGR(或DSPE ‑PEG2000‑R9)＝20:5:1溶于 氯仿中， 在45℃下用旋转蒸发仪减压蒸馏40min， 形成脂膜； 加 入300mM硫酸铵， 水浴超声水 化30min， 以形成脂质体； 用小型的脂质体挤出机过孔径100nm聚碳酸脂膜挤出20次以控制说　明　书 1/8 页 3 CN 114177306 A 3