(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110736533.6 (22)申请日 2021.06.30 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113462651 A (43)申请公布日 2021.10.01 (73)专利权人 徐州医科 大学 地址 221004 江苏省徐州市铜山路209号 (72)发明人 李慧忠　郑骏年　王刚　曹培育　 (74)专利代理 机构 北京预立 生科知识产权代理 有限公司 1 1736 代理人 孟祥斌　朱萍 (51)Int.Cl. C12N 5/10(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 15/62(2006.01) C12N 15/867(2006.01) A61K 39/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01)(56)对比文件 WO 2020063787 A1,2020.04.02 JP 2017184751 A,2017.10.12 CN 112521512 A,2021.0 3.19 Dean Nehama, et al. “B7-H3-redirected chimeric antigen receptor T cel ls target glioblastoma and neurospheres ”. 《EBioMedicine》 .2019,第47 卷 Zongliang Zhang,et al."B7- H3-Targeted CAR-T Cel ls Exhibit Potent Antitumor Effects on Hemato logic and So lid Tumors". 《Mol Ther Onco lytics》 .2020,第17 卷 Jie Liu, et al. “Targeting B7-H3 via chimeric antigen receptor T cel ls and bispecific k iller cell engagers augments antitumor respo nse of cytotoxic lymphocytes ”. 《J Hemato l Oncol》 .2021,第14 卷(第1期), 审查员 于地美 (54)发明名称 一种B7H3特异性抗性的CAR-NK细胞 (57)摘要 本发明提供了一种CAR ‑NK细胞， 所述CAR ‑NK 细胞能够地提高肿瘤细胞的杀伤效率和临床治 疗的安全性、 有效性； 同时， 本发明还提供了 所述 一种CAR‑NK在制备药物中的应用， 从而 提供了一 种具有应用前景的安全、 可靠、 高效肿瘤治疗的 新手段。 权利要求书3页 说明书8页 序列表15页 附图2页 CN 113462651 B 2022.03.01 CN 113462651 B 1.一种CAR ‑NK细胞， 所述CAR ‑NK细胞的CAR包含抗CD276的全人源特异性抗体； 所述抗 CD276的全人源特异性 抗体包含重链可变区和轻链可变区； 所述重链可变区的氨基酸序列包括VH ‑CDR1、 VH‑CDR2和VH ‑CDR3； 所述轻链可变区的氨基酸序列包括VL ‑CDR1、 VL‑CDR2和VL ‑CDR3； 所述VH‑CDR1如SEQ ID NO:1所示； 所述VH‑CDR2如SEQ  ID NO:2所示； 所述VH‑CDR3如SEQ  ID NO:3所示； 所述VL‑CDR1如SEQ ID NO:4所示； 所述VL‑CDR2如SEQ  ID NO:5所示； 所述VL‑CDR3如SEQ  ID NO:6所示。 2.如权利 要求1所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述重链可变区的氨基酸序列完整序 列如SEQ ID NO:7所示。 3.如权利 要求1所述的CA R‑NK细胞， 其特征在于， 所述重链可变区的核酸序列如SEQ  ID  NO:9所示。 4.如权利 要求1所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述轻链可变区的氨基酸序列完整序 列如SEQ ID NO:8所示。 5.如权利 要求1所述的CA R‑NK细胞， 其特征在于， 所述轻链可变区的核酸序列如SEQ  ID  NO:10所示。 6.如权利 要求1所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述重链可变区和轻链可变区之间由 接头连接。 7.如权利要求6所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述接头的氨基酸序列如SEQ  ID NO: 11所示。 8.如权利要求6所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述接头的核酸序列如SEQ  ID NO:12 所示。 9. 如权利要求1所述的CA R‑NK细胞， 其特征在于， 所述抗CD276的全人源特异性抗体的 完整氨基酸序列如SEQ  ID NO:13所示。 10. 如权利要求1所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述抗CD276的全人源特异性抗体 的核酸序列如SEQ  ID NO:14所示。 11.如权利要求1所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述CAR ‑NK细胞的CAR还包含铰链 区、 跨膜结构域、 共刺激结构域和胞内信号传导结构域中的至少一种。 12.如权利要求1 1所述的CAR ‑NK细胞， 其特 征在于， 所述铰链区选用CD 8α 铰链区。 13.如权利 要求11所述的CA R‑NK细胞， 其特征在于， 所述跨膜结构域选用CD8α 跨膜结构 域。 14.如权利要求11所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述共刺激结构域选用CD137的胞 内结构域。 15.如权利 要求11所述的CA R‑NK细胞， 其特征在于， 所述胞内信号传导结构域选用CD3ζ 的胞内信号传导结构域。 16.如权利要求11所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述CAR的完整结构的氨基酸序列 如SEQ ID NO.16所示。权　利　要　求　书 1/3 页 2 CN 113462651 B 217.如权利要求11所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述CAR的完整结构的核酸序列如 SEQ ID NO.18所示。 18.如权利要求1所述的CAR ‑NK细胞， 其特 征在于， 所述CAR还与信号肽相连。 19.如权利要求18所述的CAR ‑NK细胞， 其特 征在于， 所述信号肽连接在CAR的N端。 20.如权利 要求18所述的CA R‑NK细胞， 其特征在于， 所述信号肽的氨基酸序列如SEQ  ID  NO.23所示。 21.如权利 要求18所述的CA R‑NK细胞， 其特征在于， 所述信号肽的核苷酸序列如SEQ  ID  NO.24所示。 22. 如权利要求18所述的CA R‑NK细胞， 其特征在于， 所述信号肽和CA R连接后的氨基酸 序列如SEQ  ID NO.15所示。 23. 如权利要求18所述的CA R‑NK细胞， 其特征在于， 所述信号肽和CA R连接后的核酸序 列如SEQ ID NO.17所示。 24.如权利要求11所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述CAR ‑NK细胞的CAR还与IL ‑15连 接。 25.如权利要求24所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述CAR ‑NK细胞的CAR和IL ‑15之间 还连接有自我剪切序列。 26.如权利要求24所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述IL ‑15的氨基酸序列如SEQ  ID  NO:21所示。 27. 如权利要求24所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述IL ‑15的核酸序列如SEQ  ID  NO:22所示。 28.如权利要求25所述的CAR ‑NK细胞， 其特 征在于， 所述自我剪切序列是2 A肽。 29.如权利要求28所述的CAR ‑NK细胞， 其特 征在于， 所述2 A肽选用T2 A。 30.如权利要求29所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述T2A的氨基酸序列如SEQ  ID  NO:19所示。 31. 如权利要求29所述的CAR ‑NK细胞， 其特征在于， 所述T2A的核酸序列如SEQ  ID NO: 20所示。 32.一种经改造的NK细胞， 所述细胞包含编码权利要求1所述CAR ‑NK细胞中CAR的核酸 分子或其所在的载体。 33.如权利要求32所述的NK细胞， 其特征在于， 所述载体上还有与权利要求1所述CAR ‑ NK细胞中的CAR相连的信号肽、 T2 A或IL‑15的核酸序列。 34.如权利要求33所述的NK细胞， 其特征在于， 所述载体上CAR、 信号肽、 T2A或IL ‑15的 核酸序列的连接顺序是信号肽 ‑CAR‑T2A‑IL‑15。 35.如权利要求34所述的NK细胞， 其特征在于， 所述信号肽 ‑CAR‑T2A‑IL‑15的核酸序列 如SEQ ID NO.33所示。 36.如权利要求32所述的NK细胞， 其特 征在于， 所述载体是逆转录病毒载体。 37.如权利要求3 6所述的NK细胞， 其特 征在于， 所述逆转录病毒载体是MSCV。 38.一种制备权利 要求1所述CA R‑NK细胞或权利要求32所述的经改造的NK细胞的方法， 其特征在于， 所述方法包括将编码 权利要求1所述CAR ‑NK细胞中CAR的核酸分子所在的载体 引入NK细胞。权　利　要　求　书 2/3 页 3 CN 113462651 B 3