(19)中华 人民共和国 国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202110889463.8 (22)申请日 2021.08.04 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 113577265 A (43)申请公布日 2021.11.02 (73)专利权人 明济生物制药 （北京） 有限公司 地址 102629 北京市大兴区中关村科技园 区大兴生物医药产业基地宝 参南街16 号院1号楼 2层201 (72)发明人 亓爱杰　李少波　姜广建　 (74)专利代理 机构 南京中高专利代理有限公司 32333 代理人 潘甦昊 (51)Int.Cl. A61K 39/395(2006.01) A61K 35/17(2015.01)A61K 31/519(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (56)对比文件 WO 2021021761 A1,2021.02.04 CN 111344402 A,2020.0 6.26 Hyun-Bae Jie等.CTLA-4+ Regulatory T Cells Increased i n Cetuximab Treated Head and Neck Cancer Patients Sup press NK Cel l Cytotoxicity and Cor relate w ith Poor Prognosis. 《American As sociation for Cancer Researc h.》 .2015,第1- 33页. 邱志辉等.肿瘤浸润性淋巴细胞诱 导肺癌细 胞凋亡的研究. 《现代临床医学生物工程学杂 志》 .2001,第7卷(第1期),第1- 3页. 审查员 邓雪霞 (54)发明名称 TIL细胞及其制备方法以及在癌症治疗中的 用途 (57)摘要 本发明涉及TIL细胞及其制备方法以及在癌 症治疗中的用途。 本发明提供了一种有效分离并 制备的肿瘤浸润淋巴细胞， 将所述细胞转T NF‑α 高表达后与制备的CTLA ‑4单克隆抗体和培美曲 塞一起使用能够显著的抑制肺癌肿瘤的增殖， 具 有较好的效果。 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 113577265 B 2022.04.15 CN 113577265 B 1.一种产品， 其为用于治疗肺癌的药物 组合， 由转基因的TIL细胞以及CTLA ‑4单克隆抗 体和培美曲塞组成， 所述转基因的TIL细胞为转TNF ‑a基因高表达的TIL细胞； 所述CTLA ‑4单 克隆抗体的重链可变 区序列如SEQ  ID NO： 1所示， 轻链可变区序列如SEQ  ID NO： 2所示； 所 述TIL细胞采用如下方法制备获得： 将新鲜肺癌肿 瘤组织置于含抗生素的冷Hanks ’液中浸 泡30min， 去除坏死、 出血及脂肪组织， 称重， 剪成l mm×lmm×lmm小块， 加入以RPMI1640配制 的有胶原酶 Ⅱ型的消化 酶液中震 荡消化12h， 再加入透明质酸 酶和DNA酶， 搅拌4h消化处理； 完全消化后的组织过120目铜网， 即得到含TIL和肿 瘤细胞的单细胞悬液； 将混合细胞悬液 轻轻加于小牛血清界面上， 500r／min离心15s后， 底层为瘤细胞， 将上层细胞悬液再行连续 梯度分离， 获取TIL； 将分离的TIL在含10％人AB血清的RPMI1640完全培养基中以1 ×106／ ml 初始浓度于24孔板中培养， 并加入IL ‑2 10 μg/ml， 同时加OKT3 10 μg/ml和VC  1 μg/ml， 37℃、 5％CO2孵箱培养， 3～5天传代一次， 共培 养20d， 即得到目的TI L细胞。 2.转基因的TIL细胞以及CTLA ‑4单克隆抗体和培美曲塞的组合在制备用于治疗肺癌的 药物组合物中的用途； 所述转基因的TIL细胞为转TNF ‑a基因高表达的TIL细胞； 所述CTLA ‑4 单克隆抗体的重链可变 区序列如SEQ  ID NO： 1所示， 轻链可变区序列如SEQ  ID NO： 2所示； 所述TIL细胞采用如下方法制备获得： 将新鲜肺癌肿 瘤组织置于含抗生素的冷Hanks ’液中 浸泡30min， 去除坏死、 出血及脂肪组织， 称重， 剪成lmm ×lmm×lmm小块， 加入以RPMI1640配 制的有胶原酶 Ⅱ型的消化酶液中震荡消化12h， 再加入透明质酸酶和DNA酶， 搅拌4h消化处 理； 完全消化后的组织过120目铜网， 即得到含TIL和肿瘤细胞的单细胞悬液； 将混合细胞悬 液轻轻加于小牛血清界面上， 500r／min离心15s后， 底层为瘤细胞， 将上层细胞悬液再行连 续梯度分离， 获取TIL； 将分离的TIL在含10％人AB血清的RPMI1640完全培养基中以1 ×106／ ml初始浓度于24孔板中培养， 并加入IL ‑2 10 μg/ml， 同时加OKT3 10 μg/ml和VC  1μg/ml， 37 ℃、 5％CO2孵箱培养， 3～5天传代一次， 共培 养20d， 即得到目的TI L细胞。 3.如权利 要求2所述的用途， 其特征在于： TIL细胞的量为足以治疗有效剂量的TIL的数 量， 所述数量 为1×107至1×1010。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 113577265 B 2TIL细胞及其制备方 法以及在癌症治疗中的用途 技术领域 [0001]本发明涉及生物领域， 更具体 的涉及TIL细胞及其制备方法以及在癌症治疗中的 用途。 背景技术 [0002]肿瘤浸润 淋巴细胞(TIL)是从肿瘤组织中分离出来的肿瘤抗原特异性CD4+、 CD8+ 细胞群， 其疗效是淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的50～100倍， 其中发挥杀伤肿 瘤作用的 主要为CD8+T细胞， 大量临床研究表明TILs联合高剂量白细胞介素 ‑2(IL‑2)在晚期多发性 骨髓瘤(MM)患者中可达到约50％的阳性反应率， 且持续缓解时间较长， 使治愈MM成为可能。 在肿瘤抗原的长期刺激下， 肿瘤浸润淋巴细胞表面的一些抑制性受体(PD ‑1， CTLA‑4， Tim‑ 3， LAG‑3等)表达水平上调， 处于 “衰竭”状态， 大量研究表明， 阻断这些抑制性受体通路可使 TILs功能恢复， 可明显提高TILs的杀伤肿瘤能力， TILs在肿 瘤免疫治疗中具有极其重要的 作用， 这为肿瘤的靶向治疗提供了依据。 Ln ‑145是一种最新开发的TIL治疗方法， 2019年， FDA授予肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)治疗方法LN ‑145为突破性的治疗指定， 这是用于实体瘤的 细胞免疫疗法首次获此殊荣， 预计2021年上市， 一旦FDA批准， 这将是首款用于实体瘤的细 胞免疫疗法， 将给癌症患者带来巨大的生存获益。 [0003]关于TIL的抗肿瘤机制， 目前已经得到证实的是： ①直接杀伤作用： TIL杀伤肿瘤细 胞主要依赖其中的CTL的有效激活和有效行使功能。 T细胞转化为效应细胞， 需要有两个刺 激信号： 第一激活信号由TCR与抗原肽： 主要组织相容性复合体(MHC)分子复合物结合提供； 第二激活信号由T细胞上的CD28与抗原 递呈细胞(APC)上的B7分子结合提供。 分化 成熟的效 应T细胞经过识别与结合、 细胞器重排与颗粒外吐、 CTL解离、 靶细胞解体四个阶段发挥 其杀 伤功能， 特异性裂解靶细胞； ②Fas介导的细胞凋亡： 淋巴细胞通过表 面的Fas配体与靶细胞 上的Fas结合， 引起细胞DNA的片段化， 导致细胞发生凋亡； ③穿孔素(performingprotein， PFP)/颗粒酶B(granymeB， GranB)介导的细胞凋亡： CTL可以通过外吐胞质颗粒， 释放颗粒内 容物， 杀伤靶细胞。 穿孔素可以在 靶细胞膜上聚合， 形成穿膜孔道从而裂解靶细胞。 颗粒酶B 能够通过依赖/非依赖caspase途径诱导凋亡； ④TIL分泌的一些炎性细胞因子， 如TNFct, IL2等介导的细胞溶解与凋亡， 该途径可通过释放颗粒或直接细胞接触杀伤靶细胞。 已经发 展的各项研究表明， TI L治疗将有 待不断改进和发展， 最终将成为人类抗癌的新武器。 [0004]肺癌常伴恶性胸腔积液， 这与胸膜转移后渗出有关。 临床上常应用胸腔穿刺抽 液 及胸腔内注入顺铂(DDP)、 丝裂霉素C(MMC)、 博莱霉素(BLM)等化疗 药物治疗， 但许多肿瘤化 疗药物短期使用可以使癌细胞死亡， 长期使用容易使癌细胞产生耐药性， 导致对肿瘤特异 杀伤性不 强。 TIL与化疗 药物的联合应用或交替应用可以提高患者生存期 。 常用的提取治疗 肺癌用的TIL有三种途径： (1)从恶性胸腔积液中提取， 取肝素抗凝无菌胸腔积液离心后， 制 备细胞悬浮于Hank液， 辅助以淋巴细胞分离液， 收集界面上细胞。 以10％人AB血清及rIL ‑2 培养， 根据扩增及代谢情况按需换液。 (2)从手术切除的瘤体或活检标本中提取， 将获得的 组织消化解离， 消化后的单个细胞悬液经非连续密度梯度离心， 即可获得较纯的TIL。 (3)转说　明　书 1/6 页 3 CN 113577265 B 3