ICS 65.020.20 B 05 牡 DB2310 丹 江 市 地 方 标 准 DB 2310/T 007—2019 黑木耳液体菌种生产技术规程 2019 - 12 - 02 发布 牡丹江市市场监督管理局 2019 - 12 - 02 实施 发 布 DB2310/T 007—2019 前  言 本标准依据 GB/T 1.1-2009的编写规则起草。 本标准由黑龙江省食用菌标准化技术委员会牡丹江分委员会提出并归口。 本标准起草单位：黑龙江省农业科学院牡丹江分院。 本标准主要起草人：王延锋、于海洋、张运岐、罗连富、贾利阳、杨峰山、丁仕波、史磊、张荣芳、 高天一、董雪梅、王金贺、刘姿彤、谷维、潘春磊、盛春鸽、张鹏、宋佳鑫、赵鹤、赵静。 I DB2310/T 007—2019 黑木耳液体菌种生产技术规程 1 范围 本标准规定了黑木耳(Auricularia heimuer)液体菌种生产的生产条件、菌种选择、液体菌种生产技术要求、 菌种保藏及运输、记录与档案。 本标准适用于黑木耳液体菌种的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 150 压力容器 GB 3095 环境空气质量标准 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 11165 实验室 pH 计 GB/T 12728 食用菌术语 GB/T 13554 高效空气过滤器 GB 15618 土壤环境质量 农用地土壤污染风险管控标准 GB 22207 容积式空气压缩机 安全要求 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 2375 食用菌生产技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 品种 经不同方法选育出来的具有特异性、遗传型、稳定性，适用于液体发酵、固体栽培的食用菌菌种。 3.2 黑木耳液体菌种 用液体培养基，在生物发酵罐中，通过深层培养（液体发酵）技术生产的液体形态的黑木耳菌种。 3.3 液体菌种发酵罐 也称之为食用菌液体菌种培养器，是指进行食用菌液体菌种培养的专用设备。要求不锈钢材质，符 1 DB2310/T 007—2019 合GB 150要求。 3.4 起始 pH 液体培养基配制后尚未灭菌的pH。 3.5 终止 pH 液体菌种达到放罐指标时的培养基pH。 3.6 发酵罐空消 对尚未投料的空发酵罐进行高压蒸汽灭菌。 3.7 发酵罐实消 对投料后的发酵罐及发酵罐内培养基进行高压蒸汽灭菌。 3.8 接种量 接入发酵罐中的食用菌菌种的数量，以菌种体积与培养基体积的百分比表示。 3.9 通风量 发酵罐培养液体菌种过程中每分钟通入培养基的无菌空气的量，以培养基体积/通入空气体积表示。 3.10 液体菌种菌龄 指菌种接入培养基后，液体菌种的生长发育时间。 3.11 放罐 液体菌种菌丝生长旺盛，达到生长对数期时结束培养，在无菌条件下从发酵罐通过传送管在0.15MPa 压力下，注射接种到栽培袋中。 3.12 镜检 指通过显微镜观察液体菌种的菌丝生长发育状态以及是否有杂菌污染。 4 生产条件 4.1 厂址选择 2 DB2310/T 007—2019 应建立在交通便利，地势干燥，通风良好，水源充足，远离禽畜舍、垃圾堆积场，无污水、废气、废 渣和粉尘等污染源。水质应符合 GB 5749 的规定；大气应符合 GB 3095 的规定；土壤环境质量应符合 GB 15618 的规定。 4.2 厂房设置和布局 液体发酵间和接种间按照 GB 50073 洁净厂房设计规范执行，应按液体菌种生产工艺流程合理安排布 局，无菌区与有菌区有效隔离。 4.3 基础设备 菌种配制室、灭菌室、无菌净化操作室、恒温培养室、发酵罐培养室、化验室和菌种室，要有调温设 施，排水系统，排气设备，进入无菌区缓冲间，规模要配套，布局合理。 4.4 生产仪器和设备 发酵罐应符合 GB 150 的规定。 空气过滤器应符合 GB/T 13554 的规定。 空气压缩机应符合 GB 19153 的规定。 高压蒸汽灭菌锅应符合 GB 150 的规定 净化工作台、冰箱、磅秤、天平、液体菌种接种枪、恒温回旋式振荡器应符合相关的使用规定。 4.5 检验设备 恒温培养箱、显微镜、天平、酸度计等、玻璃三角瓶、试管、培养皿、定量定性滤纸、精密 pH 试纸 等。 5 菌种选择 应选用适于当地栽培、发菌出耳及转潮快、抗逆性强、优质、高产、商品性好，经省级以上农作物品 种审定委员会审（认）定的品种。菌种生产应符合 NY/T 528 的规定。 6 液体菌种生产技术要求 6.1 工艺流程 按照图 1 的工艺流程进行黑木耳液体菌种的生产。 3 DB2310/T 007—2019 图 1 液体菌种生产工艺流程 6.2 6.2.1 母种制备 母种培养基的制作 按照附录 A.1 配方配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）或附录 A.2 配方配制综合马铃薯葡萄糖琼脂 培养基（CPDA），分装至试管长度五分之一处，使用棉塞或胶塞封住试管口，放入高压蒸汽灭菌锅中，温 度 121℃，灭菌 30min，灭菌结束摆放斜面冷却凝固。 6.2.2 接种与培养 无菌条件下，用接种钩取黄豆粒大小的原始菌种接种在母种培养基上恒温培养箱中培养，培养温度 25℃±1℃，相对湿度 50%-70%，避光培养 10d-15d。 6.3 6.3.1 摇瓶菌种制备 摇瓶培养基的制作 按照附录 B.1 配方配制培养基，用水应符合 GB 5749 要求。将配方中的原料煮沸 20min-30min，宜用 三层纱布过滤，将滤液分装入 500mL-1000mL 三角瓶中，装液量为三角瓶容积的 70%，放入 15-20 个玻璃珠， 用封口膜封口，灭菌压力为 0.125Mpa，灭菌时间 40min。灭菌时加盖牛皮纸防潮。 6.3.2 接种与培养 无菌条件下，用接种铲将母种接入摇瓶液体培养基中，每瓶接 15-20 块，接种完成贴好标签置于 25℃ 恒温培养箱内静置 24h 后放置震荡培养箱内振荡培养， 震荡频率为 150r/min-180r/min， 培养时间为 5d-7d， 培养温度为 25℃-28℃。培养期间定期检查，除去污染或异常菌种，并留样用于检测。 6.4 6.4.1 液体菌种制备 投料前准备 检查发酵罐罐体有无变形，全部阀门、压力表、控制面板，有内置电加热棒的发酵罐，加热棒是否完 好，有无漏电，是否能够正常工作。 对罐体内、外用流水进行冲洗，达到无死角、内壁无任何培养料残余物。 4 DB2310/T 007—2019 发酵罐每次使用前要对罐体进行空消，有内置加热棒的空消时加水必须没过加热棒，121℃-124℃ 灭菌 60min；用外源蒸汽灭菌的发酵罐，蒸汽压力达到 0.105Mpa-0.125Mpa，121℃-124℃灭菌 40min。 6.4.2 液体培养基的制作 按照附录 B.2 配方配制培养基，用水应符合 GB 5749 要求。 6.4.3 投料与定容 将原材料用冷水溶解，倒入或用泵抽入发酵罐中，加水定容至罐体规定体积，如果用到马铃薯等固体 原料需要提前用开水煮沸30min，宜用三层纱布过滤，再将滤液与其他培养料搅拌均匀。 6.4.4 起始 pH 起始 pH 为 6.5-6.8，如需调节可用盐酸和氢氧化钠。 6.4.5 发酵罐实消 发酵罐内蒸汽压力达到 0.125 Mpa，温度达到 124℃时，内置罐需下排料 1 次，外置罐需要上下排料 各 1 次，灭菌时间保持 60min，温度上升过程需将排气阀微开防止罐体内形成假压，保压过程保持排气阀 微开。 6.4.6 冷却 灭菌结束后将冷水通入发酵罐夹层或内置冷却系统中循环降温，降温过程中向发酵罐内通入无菌空气 同时打开排气阀，培养基温度降温至 24℃-28℃停止通入冷凝水，罐内压力维持在 0.05Mpa。 6.4.7 接种 按下列步骤完成： a）用无菌水喷洒发酵罐上方进行降尘处理； b）在接种口放置内径略大于接种口并蘸有 95%酒精的纱布火焰圈，点燃火焰圈； c）调节压力表，使发酵罐内压降至 0.01Mpa，打开入料口同时关闭排气阀，火焰旁打开已经表面消毒 的摇瓶菌种封口膜，灼烧瓶口后迅速将菌种倒入发酵罐中； d）用火焰外焰灼烧接种口盖，迅速拧紧，移走火焰圈同时打开排气阀，调整压力表保持发酵罐压力 在 0.03Mpa-0.05Mpa。 6.4.8 液体菌种培养 培养阶段应满足下列条件： a) 罐内换气量 1︰0.5 -1：1.2 V／V(料液体积／空气体积)； b) 罐压保持在 0.03Mpa-0.05 Mpa； c) 培养温度 24℃-28℃； d) 培养时间 5d-7d。 6.4.9 液体菌种检测 取样：接种 1d 后进行隔天检测，用酒精灯外焰灼烧取样阀，弃掉最初流出液体，取一定量的液体流 入无菌三角瓶中，备用。 5 DB2310/T 007—2019 检测：将样品在 PDA 平板培养基上培养，观察是否有杂菌污染，无杂菌污染观察菌落生长情况，达到 放罐指标（见附录 C）即可放罐，放罐前 48h 对菌种进行再次检测。 6.5 留样 菌种和培养基均应留样备查： a) 母种以每个批号 3 支-5 支，于 4℃冰箱下贮存，贮存至经转接的栽培袋正常发菌； b) 摇瓶菌种使用时取样 30 mL-40 mL，用三角瓶留存； c) 发酵罐实消后的空白培养基取样 30 mL-40 mL，用三角瓶留存； d) 放罐前 48h 从发酵罐中取样 30 mL-40 mL，用三角瓶留存； e) 发酵终止后取样 80 mL-100 mL，用三角瓶留存。 注：样品放置 2℃-4℃保存 7 天。 7 菌种保藏及运输 液体菌种生产好后，应立即进入菌种生产或栽培袋接种使用，若因某些原因不能立即使用时需降温保 压处理。一般在 4℃－10℃下存放不超过 2d。液体菌种不宜长途运输。 8 记录与档案 应建立生产档案，内容包括产地环境、品种选择和质量要求，母种、摇瓶液体种和发酵罐液体菌种生 产的每个环节等。生产记录由具体操作人员现场记录填写，定期由主管领导审核，签字后归档，档案保存 至少 3 年。 6 DB2310/T 007—2019 附 录 A （规范性附录） 常用母种培养基及配方 A.1 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）配方：马铃薯 200g（浸出汁） ，葡萄糖 20g，琼脂 20g，水定容至 1000mL，pH 自然。 A.2 综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CPDA）配方：马铃薯 200g（浸出汁），葡