ICS 65.020.20 B 16 DB12 天 津 市 地 方 标 准 DB12/T 986—2020 豆芽中 6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、 2,4-滴和赤霉素的测定 液相色谱-串联质 谱法 Determination of residues of 6-benzylam inopurine, 4-chlorphenoxyacetic sodium, 2, 4-D and gibberellic acid in bean sprout by liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2020 - 10 - 14 发布 天津市市场监督管理委员会 2020 - 11 - 15 实施 发 布 DB12/T 986—2020 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。 本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所。 本标准主要起草人：李娜、邵辉、林宏芳、刘磊、李辉、张玉婷、郭永泽、卢娜、绳慧珊、梁静。 I DB12/T 986—2020 豆芽中 6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、2,4-滴和赤霉素的测定 液 相色谱-串联质谱法 1 范围 本标准规定了豆芽中6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、2,4-滴和赤霉素残留量的测定-液相色谱串联质谱法的方法提要、试剂和材料、仪器和设备、试样制备与保存、测定步骤、灵敏度、准确度和精 密度。 本标准适用于豆芽中6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、2,4-滴和赤霉素单个或混合物残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 方法提要 试样经酸化乙腈提取，提取液浓缩、甲醇定容后，用液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）测定，基 质外标法定量。 4 试剂和材料 4.1 基本要求 除另有说明外，所用试剂均为分析纯。所用水为GB/T 6682规定的一级水。 4.2 乙腈 色谱纯。 4.3 甲醇 色谱纯。 4.4 甲酸 色谱纯 4.5 6-苄基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸钠、2,4-滴和赤霉素标准品 纯度≥98.0%。 4.6 标准溶液的配制 1 DB12/T 986—2020 4.6.1 标准储备溶液（200 mg/L）：准确称取各种标准品 10 mg（精确至 0.1 mg），用甲醇溶解并定 容至 50 mL， -18℃避光保存，有效期 6 个月。 4.6.2 混合标准溶液：分别吸取一定量各种农药标准储备液于 50 mL 容量瓶，用甲醇稀释并定容至刻 度，配制浓度为 10 mg/L 的混合标准溶液， 0~4℃避光保存，有效期 1 个月。 4.6.3 基质匹配标准工作溶液：用空白豆芽基质配制浓度分别为 0.005、0.02、0.05、0.2、0.5、1.0 mg/L 的系列标准溶液，供液相色谱-串联质谱仪分析，现用现配。 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 液相色谱-串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI）。 分析天平：感量 0.0001 g 和 0.01 g。 台式高速离心机：转速不低于 4000 r/min。 匀浆机。 涡旋混合器。 旋转蒸发仪。 纯水仪。 6 试样制备与保存 样品用四分法缩分出适量，经匀浆机捣碎，分取两份试样，装入清洁容器内，密封并标记。一份作 为检样，一份作为留样，于-18℃保存。 7 测定步骤 7.1 样品前处理 准确称取捣碎的试样5.00 g（精确至0.02 g）于50 mL聚丙烯离心管中，加入20 mL乙腈，于旋涡混 合器上涡旋2 min，加入0.4 mL甲酸，再涡旋2 min，4000 r/min离心5 min，上清液转移至100 mL梨形 瓶中，于40℃条件下旋转蒸发至约2.5 mL，转移至刻度试管中，用甲醇定容至5 mL，过0.22 µm有机滤 膜，供液相色谱-串联质谱仪分析。 7.2 仪器测定 7.2.1 液相色谱参考条件如下： TM ——色谱柱：Acquity BEH C18 柱（2.1×50 mm，1.7 μm）； ——流动相：A 相：乙腈；B 相：0.1%甲酸水；梯度洗脱条件见表 1。 ——进样量：10 μL； ——柱温：30 ℃。 表1 梯度洗脱条件 时间(min) 流速(mL/min) VA(%) VB(%) 0 0.2 10 90 3 0.2 90 10 4 0.2 90 10 2 DB12/T 986—2020 4.01 0.2 10 90 5 0.2 10 90 7.2.2 质谱参考条件如下： ——电离模式：电喷雾电离 (ESI) ——毛细管电压：3.0 kV； ——离子源温度：120 ℃； ——脱溶剂气温度：400 ℃； ——脱溶剂气流量：600 L/hr； ——锥孔反吹气流量：60 L/hr； ——检测方式：多反应监测（MRM）； 质谱采集参数见表2。 表2 4 种化合物的中英文名称、保留时间和质谱检测条件 保留时间 名称 (min) 电离方式 6-苄基腺嘌呤 (6-benzylam 1.76 ESI+ 1.80 ESI- 2.54 ESI- 2.81 ESI- inopurine) 赤霉素 (gibberellic acid) 4-氯苯氧乙酸钠 (4-chlorphenoxyaceti c sodium) 2, 4-滴 (2, 4-D) 定性离子对 定量离子对 锥孔电压 碰撞能量 (m/z) (m/z) (V) (V) 226.2>91.0 37 345.2>239.0 25 184.8>126.5 23 219.0>160.5 21 226.2>91.0 226.2>147.9 345.2>142.8 345.2>239.0 184.8>126.5 184.8>140.5 219.0>124.5 219.0>160.5 25 17 25 15 13 10 26 14 7.3 定性 以表3中保留时间及定性离子定性，用液相色谱-串联质谱法确证应同时满足三个要求：待测样品的 保留时间在外标标准品的保留时间的±2.5%之内；定性离子的信噪比大于3（S/N>3）；与外标标准品相 比，样品的两个离子相对丰度在表3规定的许可范围内。空白添加样品中4种化合物的总离子流色谱图和 特征离子的色谱图参见附录A。 表3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度比（%） 允许的最大偏差（%） >50 ±20 >20~50 ±25 >10~20 ±30 ≤10 ±50 7.4 结果计算 以浓度为横坐标，以定量离子的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，采用外标法定量。采用单点或者 多点校准。用色谱数据处理软件或按公式（1）计算试样中的目标物含量（mg/kg）。 3 DB12/T 986—2020   s  A V  ..................................... (1) As m 式中： ω——试样中目标物的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； ρs目标物标准工作溶液的浓度，单位为微克每升（mg/L）； A 试样测定液中目标物定量离子的峰面积； As 标准工作溶液中目标物定量离子的峰面积； V 试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）； m 试样溶液所代表试样的量，单位为克（g）； 注：计算结果保留两位有效数字，当结果大于1 mg/kg时保留三位有效数字。 8 灵敏度 豆芽中6-苄基腺嘌呤的定量限为0.005 mg/kg， 2,4-滴的定量限为0.02 mg/kg，4-氯苯氧乙酸钠、 赤霉素的定量限为0.05 mg/kg。 9 准确度和精密度 9.1 准确度 9.1.1 豆芽中 6-苄基腺嘌呤在 0.005 mg/kg～0.5 mg/kg 添加水平上的回收率在 70%～120%之间； 9.1.2 豆芽中 2,4-滴在 0.02 mg/kg～0.5 mg/kg 添加水平上的回收率在 70%～120%之间； 9.1.3 豆芽中 4-氯苯氧乙酸钠、赤霉素在 0.05 mg/kg～0.5 mg/kg 添加水平上的回收率在 70%～120% 之间。 9.2 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。 4 DB12/T 986—2020 AA 附 录 A （资料性附录） 4 种化合物的总离子流（TIC）色谱图和多反应监测（MRM）色谱图 4种化合物的总离子流（TIC）色谱图见图A.1。 2: MRM of 2 Channels ES+ TIC (6-BA) 2.74e7 1.76 95 % -5 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 2.81 95 4.00 4.50 5.00 1: MRM of 6 Channels ESTIC 7.49e4 1.80 % 2.54 -5 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 Time 5.00 注1：1.76 min -6-苄基腺嘌呤 注2：1.80 min -赤霉素 注3：2.54 min -4-氯苯氧乙酸钠 注4：2.81 min -2,4-滴 图A.1 4 种化合物的总离子流（TIC）色谱图 4种化合物的多反应监测（MRM）色谱图见图A.2。 5 DB12/T 986—2020 226.2 > 147.9 (6-BA) 5.22e5 1.75 95% -5 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 4.00 4.00 3.00 3.50 4.00 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 2.81 95 % -5 0.50 1.0