ICS 65.020.01 CCS B 39 22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 3312—2021 柞蚕蛹虫草菌种生产技术规程 Code of practice for spawn production of Cordyceps militaris in Antheraea pernyi 2021 - 11 - 26 发布 2021 - 12 - 15 实施 吉林省市场监督管理厅 发 布 DB 22/T 3312—2021 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的 规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：吉林省蚕业科学研究院。 本文件主要起草人：周影、李森、朱兴友、祝长杰、王芹、刘娟。 I DB 22/T 3312—2021 柞蚕蛹虫草菌种生产技术规程 1 范围 本文件确立了柞蚕蛹虫草菌种生产的程序，规定了生产条件、菌种来源、母种生产、液体菌种 生产、包装、贮存和运输阶段的操作指示，描述了生产记录等追溯方法。 本文件适用于柞蚕蛹虫草母种和液体菌种（栽培种）的生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用 文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 12728—2006 食用菌术语 NY/T 528—2010 食用菌菌种生产技术规程 3 术语和定义 GB/T 12728—2006 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 柞蚕蛹虫草 north cordyceps 蛹虫草菌（Cordyceps militaris（L.ex Fr.）Link）寄生于柞蚕蛹上形成的子实体与蛹的复 合体。 3.2 母种 stock culture 经组织分离获得的具有结实性的蛹虫草菌丝体纯培养物及其继代培养物。 [来源：GB/T 12728—2006，2.5.7，有修改] 3.3 出草 growing fruiting body 菌丝在柞蚕蛹体内生长至表面形成原基，由原基发育成子实体的过程。 3.4 僵化 fossilization 柞蚕蛹接种蛹虫草菌种后，蛹体变僵硬的状态。 3.5 液体菌种 liquid spanw 母种接种于液体培养基扩繁而来的纯菌丝体栽培种。 3.6 菌丝转色 mycelium change colour 在有光条件下，菌丝由白色转为橙黄或橙色。 3.7 气生菌丝 aerial hypha 生长在培养基表面空间的菌丝。 1 DB 22/T 3312—2021 [来源：GB/T 12728—2006，2.2.7] 4 柞蚕蛹虫草菌种生产程序的构成 柞蚕蛹虫草菌种的生产程序包括 5 个阶段。程序流程图如图 1 所示。 1 生产条件（见 5.1） 2 菌种来源（见 5.2） 3 母种生产（见 5.3） 4 液体菌种生产（见 5.4） 5 包装贮存运输（见 6） 图1 柞蚕蛹虫草菌种生产程序 5 生产技术 5.1 生产条件 5.1.1 场地环境要求 场地环境应符合 NY/T 528—2010 中 4.2 的规定。 5.1.2 厂房设置 应设有原料准备室、洗刷室、灭菌间、冷却室、接种室、培养室、菌种检验室、菌种贮存室和 出草试验室等，并合理布局。 5.1.3 设施设备 设施设备应符合 NY/T 528—2010 中 4.4 的规定。 5.2 菌种来源 5.2.1 应使用种性清楚或者是经过农作物品种审定委员会登记的蛹虫草菌种。 5.2.2 母种在扩繁之前应进行出草试验，性状稳定的方可投入生产使用,出草试验设 3 次重复，每次 重复至少接种 2 kg 优质柞蚕蛹。 5.2.3 接种柞蚕蛹后，僵化率和出草率应在 70% 以上，培养 40 d～45 d 时，子实体长度应在 4 cm～ 8 cm 之间，且直立、整齐、多且密、橙黄。 5.3 母种生产 2 DB 22/T 3312—2021 5.3.1 试管扩繁 5.3.1.1 培养基配制 配方及配制方法见附录 A.1。 5.3.1.2 分装 配制好的培养基分装至 18 mm×180 mm 或 20 mm×200 mm 的玻璃试管中，分装量为试管长度 的四分之一；试管口保持干净，塞入棉塞，并用牛皮纸包扎。 5.3.1.3 灭菌 将分装好的试管直立置于高压蒸汽灭菌锅， 121 ℃ 维持 30 min，当温度降至 80 ℃～90 ℃ 时，灭菌锅放气阀无蒸汽排出时，方可开启锅盖，取出试管。 5.3.1.4 冷却 趁热将试管的一端斜放在 1 cm 厚的木条上摆出斜面，斜面的长度为试管长度的三分之二，斜 面顶端距棉塞的距离为 4 cm～5 cm，进行冷却、凝固。 5.3.1.5 接种 无菌条件下，用经火焰消毒并冷却后的接种耙切取 3 mm～5 mm×3 mm～5 mm 的一块母种迅速 转接于待接试管斜面培养基中央，接种后塞好棉塞。 5.3.1.6 培养 在（22±2）℃ 条件下避光培养 7 d～10 d，菌丝长满斜面后见光培养，菌丝转色后保藏于 4 ℃ 冰箱中。 5.3.1.7 检验 接种后第 3 d、第 6 d 和菌丝体长满培养基后逐个进行检验，挑出未活、污染和生长不良的 培养物，质量应符合表 1 的要求。 表1 试管扩繁要求 项目 要求 容器 完整、洁净、无破损、无裂纹 棉塞 干燥、洁净，松紧适中，透气 培养基灌入量 试管总容积的四分之一 斜面长度 顶端距棉塞 4 cm～5 cm 菌丝生长量 长满斜面 菌种正面外观 洁白、粗壮、浓密、绒毛状气生菌丝，见光后菌丝 24 h 内变为 检验方法 肉眼观察 测量 肉眼观察 橙黄或橙色，均匀、无角变，无原基，表面无分泌物，无杂菌 斜面背面外观 培养基无干缩，气生菌丝与基质结合部位呈黄色，均匀，无暗斑 菌丝形态 生长 5 d～7 d，菌丝粗壮、挺立，无空泡，分生孢子饱满、密集 显微镜下观察 5.3.2 三角瓶扩繁 3 DB 22/T 3312—2021 5.3.2.1 培养基配制 配方及配制方法见附录 A.1。 5.3.2.2 分装 将配制好的培养基分装于 150 mL 无色耐高温玻璃三角瓶中，每瓶分装量为 40 mL，瓶口保持 干净，塞好棉塞，并用牛皮纸包扎，培养基上表面距棉塞 5 cm～5.5 cm。 5.3.2.3 灭菌 分装后置于高压蒸汽灭菌锅，121 ℃ 维持 30 min，当温度降至 80 ℃～90 ℃ 时，灭菌锅放 气阀无蒸汽排出时，方可开启锅盖，取出三角瓶。 5.3.2.4 冷却 趁热摆放于洁净台面上进行冷却、凝固。 5.3.2.5 接种 无菌条件下，用经火焰消毒并冷却后的接种耙切取 3 mm～5 mm×3 mm～5 mm 大小的菌块置于 培养基上，每管试管扩接 40 瓶～50 瓶三角瓶。 5.3.2.6 培养 在（22±2）℃ 条件下避光培养 8 d～11 d，菌丝长满后见光培养，菌丝转色后保藏于 4 ℃ 冰 箱中。 5.3.2.7 检验 接种后第 3 d、第 7 d 和菌丝体长满培养基后逐个进行检验，挑出未活、污染和生长不良的 培养物，质量应符合表 2 的要求。 表2 三角瓶扩繁要求 项目 要求 容器 完整、洁净、无破损、无裂纹 棉塞 干燥、洁净，松紧适中，透气 培养基灌入量 40 mL 培养基上表面距棉塞的距离 5 cm～5.5 cm 菌丝生长量 长满容器 洁白、粗壮、浓密、绒毛状气生菌丝，见光后菌丝 24 h 内变为橙 菌种外观 黄或橙色，均匀、无角变，无原基，无子实体，表面无分泌物， 检验方法 肉眼观察 测量 肉眼观察 无杂菌 菌丝形态 生长 5 d～7 d，菌丝粗壮、挺立，无空泡，分生孢子饱满、密集 5.4 液体菌种生产 5.4.1 液体培养基配制 配方及配制方法见附录 A.2。 4 显微镜下观察 DB 22/T 3312—2021 5.4.2 分装 将液体培养基分装至 500 mL 无色耐高温玻璃三角瓶中，每瓶分装量为 200 mL，并加入 20 粒～25 粒玻璃珠，瓶口保持干净，瓶塞选用无棉塑料盖，培养基上表面距离瓶口 14 cm～15 cm。 5.4.3 灭菌 分装后置于高压蒸汽灭菌锅，121℃ 维持 30 min，当温度降至 80 ℃～90 ℃ 时，灭菌锅放 气阀无蒸汽排出时，方可开启锅盖。 5.4.4 冷却 将液体培养基摆放于洁净台面上，待冷却至 30 ℃ 以下进行接种。 5.4.5 接种 无菌条件下，用经火焰消毒并冷却后的接种耙切取 4 块～6 块大小为 3 mm～5 mm×3 mm～5 mm 的母种接种于液体培养基中，每个三角瓶扩接 10 瓶～15 瓶的液体菌种。 5.4.6 培养 置于（22±2）℃ 条件下避光静止培养 24 h 后，在 150 r/min、(22±2）℃ 条件下，避光 震荡培养 96 h，液体菌种应随制随用。 5.4.7 检验 每天对液体菌种逐个检验，挑出未萌发、浑浊和生长不良的培养物，液体菌种质量应符合表 3 的要求。 表3 液体菌种要求 项目 要求 检验方法 容器 完整、洁净、无破损、无裂纹 无棉塑料盖 干燥、洁净，松紧适中，透气 培养基灌入量 200 mL 培养基上表面距瓶口的距离 14 cm～15 cm 菌丝生长时间 96 h 记录 菌液外观 菌丝絮状或球状（0.5 mm～2 mm）的澄清悬浊液 肉眼观察 杂菌 无杂菌 显微镜下观察 肉眼观察 测量 6 包装、贮存、运输 6.1 包装 6.1.1 每管或瓶均应有标识，注明厂名、级别、菌号、生产日期。 6.1.2 每管或瓶用防震撞的材料进行包装，注意间隔，以防破损，外包装选用抗挤压包装材料。 6.1.3 包装箱应标明向上放置、防潮、防冻、防日晒、防震撞的图案。 6.2 贮存 5 DB 22/T 3312—2021 母种在 4 ℃～10 ℃ 贮存不超过 60 d，液体菌种不宜贮存。 6.3 运输 运输不得挤压，碰撞，在 4 ℃～25 ℃ 条件下运输。 7 记录与档案 7.1 记录母种、液体菌种生产过程中菌种来源、僵化率、出草率、生产时间、培养条件、数量、技术 负责人、质量检验、出厂日期及菌种流向等内容。 7.2 记录应及时归档，档案保存期限为 2 年，做到可追溯。 6 DB 22/T 3312—2021 A A 附 录 A （规范性） 培养基配方及配制方法 A.1