ICS 65.150 CCS B 52 22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 3298—2021 淡水鱼肠道常见致病菌分离与纯化 技术规程 Technical code of practice on isolation and purification of common pathogenic bacteria of intestinal bacteria for freshwater fish 2021 - 11 - 26 发布 2021 - 12 - 15 实施 吉林省市场监督管理厅 发 布 DB 22/T 3298—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件中的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由吉林省农业农村厅提出并归口。 本文件起草主要单位：吉林农业大学、通化师范学院、吉林省水产技术推广总站。 本文件主要起草人：张东鸣、陈玉珂、王秋举、郭志欣、蔺丽丽、刘洪健、赵云龙、吴振超。 I DB 22/T 3298—2021 淡水鱼肠道常见致病菌分离与纯化技术规程 1 范围 本文件规定了淡水鱼肠道常见致病菌分离与纯化的实验器具、试剂和培养基、准备工作、分离纯化 和记录等。 本文件适用于淡水鱼肠道常见致病菌的分离与纯化。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4789.28 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 SN/T 2632—2010 微生物菌种常规保藏技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 肠道致病菌 intestinal pathogenic bacteria 存在于鱼类肠道中可以导致鱼类发生疾病的细菌。 注： 淡水鱼肠道中常见的致病菌有：金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus aureus ）、嗜水气单胞菌（ Aeromonas hydrophila）、大肠杆菌（Escherichia coli）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）、爱德华氏菌（Edwardsiella） 和温和气单胞菌（Aeromonas sobria）等。 4 实验器具 超净工作台、显微镜（10 倍 × 100 倍）、解剖镜、离心机（RCF 10 000 ×g ～ 30 000 ×g）、 2 2 高压蒸汽灭菌锅（灭菌压力 0 kg/cm ～ 3 kg/cm ）、医用冰箱（4 ℃ ～ 80 ℃）、电子分析天平（相 对精度 1/1000）、生化培养箱（具备制冷功能）、pH 计、匀浆器、恒温振荡器（往复式）、移液器（100 mL 和1000 mL）、漩涡混匀器（圆周震动）、酒精灯、金属接种环、玻璃涂布棒、无菌培养皿（直径 90 mm）、玻璃试管（25 mL）。 5 试剂和培养基 试剂 试剂为 75 % 乙醇，0.7 % 生理盐水，试剂均为分析纯。 1 DB 22/T 3298—2021 培养基 固体和液体培养基按表 1 执行。琼脂仅在制作 LB 固体培养基时添加，培养基质量要求符合 GB 4789.28 的规定。 表 1 LB 培养基 序号 成分 用量 1 胰蛋白胨 10.0 g 2 酵母提取物 5.0 g 3 氯化钠 10.0 g 4 琼脂 15.0 g 5 蒸馏水 1000 mL 6 准备工作 器具消毒 将剪刀、镊子、解剖刀、培养皿、玻璃试管和锥形瓶等器具采用高压蒸汽灭菌锅高压（121 ℃）灭 菌 20 min。 制备平板 6.2.1 培养基灭菌 将 LB 培养基置于锥形瓶中经高压蒸汽灭菌( 121 ℃ 灭菌 20 min)后放置于提前灭菌的无菌操作 台中，待培养基温度不烫手且未凝固时开始倒制平板。 6.2.2 倒制平板 6.2.2.1 一只手拿锥形瓶，靠近酒精灯火焰，另一只手拔出棉塞；使锥形瓶瓶口迅速通过火焰，此步 骤重复 2 次 ～ 3 次。 6.2.2.2 将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，轻轻倒入厚度为 3 mm ～ 5 mm LB 培养基，将培养 皿上盖半掩放置。 6.2.2.3 整个倒制平板过程均在超净工作台中进行。 6.2.3 平板冷却 待培养皿中培养基温度降至室温后，盖上盖子，备用。 7 分离纯化 流程图 2 DB 22/T 3298—2021 分离和纯化步骤见图 1。 取样（见7.2） 制备悬液（见7.3） 接种（见7.4） 培养（见7.5） 纯化（见7.6） 检验纯度（见7.7） 保种（见7.8） 记录（见8） 图1 分离与纯化步骤 取样 选取具有典型症状的濒死病鱼作为分离肠道致病菌的对象。用 75 % 的酒精棉球对鱼体体表消毒 后，打开腹腔，再用 75 % 酒精棉球擦拭肠管外壁，将整个肠道取出，分离前肠、中肠和后肠，备用。 制备悬液 7.3.1 用约 2 倍肠道内容物体积的无菌生理盐水将肠道内容物冲入无菌离心管中，制成细菌悬液。 7.3.2 将 7.3.1 的细菌悬液在无菌条件下涂布在 LB 培养基上 28 ℃ ～ 37 ℃ 培养 24 h，观察菌 落的生长情况。 7.3.3 根据 7.3.2 的实验结果，在无菌条件下采用无菌的生理盐水将 7.3.1 的细菌悬液稀释成不同 -3 -4 -5 倍数的稀释菌液。建议稀释倍数为：10 、10 和 10 。 接种 分别取 7.3.3 的稀释菌液 0.1 mL，在酒精灯外焰附近采用灭菌的涂布棒将菌液均匀涂布在 LB 培养基上，至液体全部被培养基吸收,每个浓度的菌液做 3 个重复。 3 DB 22/T 3298—2021 培养 在培养皿上盖表面标注样品名称、日期和采样地等信息。置于恒温培养箱中 28 ℃ ～ 37 ℃ 倒 置培养 24 h。 纯化 7.6.1 划线分离 在无菌条件下，采用接种环挑取同一培养皿中不同颜色和不同形态的单个菌落在无菌 LB 培养基 表面进行连续划线分离。在培养皿上盖表面做好标注，置于恒温培养箱中 28 ℃ ～ 37 ℃ 培养 24 h。 7.6.2 纯化时机 重复 7.6.1 操作 2 ～ 3 次。待培养基上均匀的长出颜色和形态相同的单个菌落时便可以进行细 菌的纯化培养。 7.6.3 纯化培养 采用无菌的接种环将挑取的单个菌落接种于装有无菌的 LB 液体培养基试管中，在试管上标注样 品名称、日期和采样地等信息，然后将试管置于恒温振荡器中，在温度 28 ℃ ～ 37 ℃，转速每分钟 120 转的条件下，培养 16 h ～ 18 h。 检验纯度 培养结束后按照 7.4 和 7.5 的方法再进行分离培养，若新平板中长出不同颜色或不同形态的菌 落，则需继续纯化，直至平板上长出相同的单一菌落。 保种 按照 SN/T 2632—2010 中附录 D 规定执行。 8 记录 记录内容 记录内容详见表 2。 表 2 细菌分离与纯化记录 例次 1 2 3 4 品种 鱼体特征 取样地点 取样时间 取样部位 菌液浓度 获得菌株数量 DB 22/T 3298—2021 存档 及时将记录归档，保存。 5