ICS 11.020 C 62 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/T 3762.12—2021 新型冠状病毒检测技术规范 第 12 部分：药物体外抗病毒效果测定 Technical specifications for SARS-CoV-2 detection Part 12: In vitro determination of antiviral effect of drugs 2021 - 11 - 04 发布 江苏省市场监督管理局 2021 - 12 - 04 实施 发 布 DB32/T 3762.12-2021 前 言 DB32/T 3762《新型冠状病毒检测技术规范》目前分为以下部分： ——第1部分：生物样本采集、运输和保存； ——第2部分：病毒分离与鉴定； ——第3部分：核酸荧光PCR检测程序； ——第4部分：重组酶介导等温扩增程序； ——第5部分：血清IgM和IgG抗体酶联免疫吸附检测程序； ——第6部分：血清IgM和IgG抗体胶体金免疫层析检测程序； ——第7部分：空气样本检测与评估； ——第8部分：物体表面检测与评估； ——第9部分：医务人员职业暴露检测与评估； ——第10部分：微量血清中和试验； ——第11部分：全基因组高通量测序； ——第12部分：药物体外抗病毒效果测定。 本文件为DB32/T 3762 的第12部分。 本文件按照GB/T 1.1-2020 给出的规则起草。 本文件由江苏省卫生健康委员会提出。 本文件由江苏省卫生标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：江苏省疾病预防控制中心、江苏省人民医院、江阴市疾病预防控制中心、南通市 疾病预防控制中心。 本文件主要起草人：葛以跃、崔仑标、朱宝立、迟莹、吴斌、吴涛、朱小娟、乔乔、赵康辰、刘根 焰、张宏宾、张伟。 I DB32/T 3762.12-2021 新型冠状病毒检测技术规范 第 12 部分：药物体外抗病毒效果测定 1 范围 本文件规定了新型冠状病毒药物体外抗病毒效果测定环境与设施、设备与耗材、试剂与材料、技术 要求、操作步骤和清场与消毒。 本文件适用于新型冠状病毒药物体外抗病毒效果测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版）适用于本 文件。 DB32/T 3762.3 新型冠状病毒检测技术规范 第3部分：核酸荧光PCR检测程序 新型冠状病毒实验室生物安全指南 中华人民共和国国家卫生健康委员会 医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册 中华人民共和国国家卫生健康委员会 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 细胞病变效应 cytopathic effect，CPE 病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。大多数病毒感染敏感细胞培养都能引 起其显微镜下表现的改变，如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞，细胞内出现包涵体， 乃至细胞裂解等。 3.2 感染复数 multiplicity of infection，MOI 感染时病毒和细胞数量的比值。 3.3 半最大效应浓度 half-maximal effective concentration，EC50 能引起50%最大效应的药物浓度。 3.4 半数细胞毒性浓度 Half-cytotoxic concentration，CC50 对半数细胞产生毒性作用的药物浓度。 3.5 1 DB32/T 3762.12-2021 最大无毒浓度 maximal atoxic concentration，TC0 不引起细胞毒性的最大药物浓度 3.6 选择指数 selectivity index，SI 为判断药物效果的安全范围，SI=CC50/EC50，选择指数越大，药物的安全范围越大。 4 环境与设施 4.1 实验室资质及级别要求 应符合《新型冠状病毒实验室生物安全指南》的要求，病毒培养包括病毒的分离、培养、滴定等 实验操作应当在生物安全三级实验室（BSL-3）的生物安全柜内进行。使用病毒培养物提取核酸，裂解 剂或灭活剂的加入必须在与病毒培养等同级别的实验室和防护条件下进行，裂解剂或灭活剂加入后可比 照未经培养的感染性材料的防护等级进行操作。实验室开展相关活动前，应当报经国家卫生健康委批准， 取得开展相应活动的资质。病毒核酸荧光PCR检测程序可参照DB32/T 3762.3进行。 4.2 操作人员资质及防护要求 实验操作人员应经过生物安全培训，操作活病毒人员应取得BSL-3实验室进入资质和相关实验活动 上岗证。操作人员在健康状态良好的情况下经实验室主任批准后方可开展活动，应根据《新型冠状病 毒实验室生物安全指南》要求，按照BSL-3个人防护的要求进行防护。 5 设备与耗材 5.1 设备 生物安全柜、倒置显微镜、涡旋振荡器、水浴或金属浴、冰箱、CO2培养箱、离心机、核酸提取仪、 荧光定量PCR仪、微量移液器等。 5.2 耗材 N95及以上防护口罩、医用无纺布帽、护目镜、医用防护服、一次性PE手套、一次性手术衣、乳胶 手套、防水靴套、带滤芯Tip头、一次性平皿、EP管、96孔细胞培养板、96孔PCR反应板等。 6 试剂与材料 6.1 试剂 6.1.1 6.1.2 6.1.3 6.1.4 6.1.5 6.1.6 Hanks 溶液（每毫升含青霉素、链霉素各 2000 单位） DMEM 培养液（含 10 %胎牛血清）。 DMEM 维持液（含 2 %胎牛血清）。 消化液 （0.25 %胰酶和 0.025 % EDTA-Na2 混合液）。 核酸提取试剂盒。 新型冠状病毒荧光 PCR 检测试剂盒。 2 DB32/T 3762.12-2021 6.2 材料 6.2.1 新型冠状病毒培养物。 6.2.2 待检药物和阳性对照药物（瑞德西韦）。 6.2.3 非洲绿猴肾传代细胞（VERO-E6）。 7 技术要求 7.1 病毒滴度质控：确定实验室质量控制标准的新型冠状病毒毒株滴度，应至少有三次独立的 滴度水平测定结果。 7.2 效果指标选择：药物体外抗病毒效果可通过观察病毒致 CPE、细胞活性染色、病毒噬斑减 少试验、病毒抗原测定、病毒核酸测定等方法来判断，本文件通过病毒核酸测定来评价药物体 外抗病毒效果。 7.3 毒性测定方法：药物对细胞的毒性测定可根据药物特点选用细胞病变观察或细胞活性染色 （中性红、MTT 或 CCK-8 等染色后测 OD 值）的方法进行。 7.4 预处理要求：如果待测药物是中药煎剂，必须进行无菌过滤以去处药液沉渣，以免影响结 果观察。 8 操作步骤 8.1 药物对细胞的毒性测定 8.1.1 将实验所需细胞于 96 孔培养板中置 37 ℃ 5 % CO2 培养箱培养至单层，覆盖度 80%左右，弃掉 细胞培养液。 8.1.2 待检药物稀释：将待检药物用细胞培养液做倍比稀释，使其稀释度分别为原液（选定浓度）、 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，1:256，1:512，每完成一个一稀释度必须更换吸头，每个稀释 度溶液需要反复吹打混匀。 8.1.3 分别取 200 μl 不同稀释倍数的待检药物及相同条件稀释的药物溶剂（如 DMSO）滴加于细胞培 养孔中，每一稀释度接种 4 孔，置 37 ℃ 5% CO2 培养箱中培养。 8.1.4 结果观察：显微镜下逐日观察并记录 CPE 结果，直至药物对细胞的毒性不再继续进展时判定结 果，计算待检药物的最大无毒浓度（TC0）和半数细胞毒性浓度（CC50）。 8.2 药物抗病毒效果测定 8.2.1 将实验所需细胞于 96 孔培养板中置 37 ℃ 5 % CO2 培养箱培养至单层，弃掉细胞培养液。 8.2.2 待检药物稀释：将待检药物选用最大无毒浓度，用 DMEM 维持液做倍比稀释，使其稀释度分 别为原液（最大无毒浓度）、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128，每完成一个一稀释度必须更换 吸头，每个稀释度溶液需要反复吹打混匀。 8.2.3 阳性对照药物稀释：将阳性对照药物（瑞德西韦）从 10μM 原始浓度开始，按照和待检药物相 同的稀释方法进行倍比稀释。 8.2.4 分别取 50 μl 不同稀释倍数的待检药物或阳性对照药物滴加于细胞培养孔中，每一稀释度接种 3 孔，同时设立病毒对照（不加药物）和细胞对照（不加药物、不加病毒），置 37℃ 5% CO2 培养箱中培 养 1 h。 8.2.5 将药物预处理后的细胞、病毒、药物、试剂和耗材一次性带入 BSL-3 核心区。 3 DB32/T 3762.12-2021 8.2.6 在待检药物组、阳性对照药物组和病毒对照组的细胞孔中加入新型冠状病毒（2 μl/孔，0.02 MOI），置 37 ℃ 5% CO2 培养箱中培养吸附 1 h。 8.2.7 弃培养上清，以 Hanks 液洗涤细胞 2 次后加入含有对应不同浓度药物的 DMEM 维持液，病毒 对照组和细胞对照组加不含药物的 DMEM 维持液，置 37 ℃ 5% CO2 培养箱中培养 48 h。 8.2.8 病毒灭活与核酸提取：培养结束后，在倒置显微镜下观察 CPE，并记录结果；将培养上清加入 核酸提取试剂的裂解液中，混匀后按照核酸提取试剂盒和核酸提取仪操作说明进行核酸提取。 8.2.9 核酸检测：参照 DB32/T 3762.3 进行。 8.2.10 结果计算：根据核酸检测获得的 CT 值，计算不同药物浓度下病毒被药物抑制的百分比（%）， △ 计算公式为（1-2- CT）×100 ％（其中△CT=待检药物组 CT 值-病毒对照组 CT 值）。以病毒被抑制的 百分比为纵坐标，药物浓度的对数值为横坐标，进行 Logistic 曲线拟合（四参数），计算待检药物和阳 性对照药物的 EC50 值，进一步计算待检药物的选择指数 SI（CC50 / EC50）。 8.2.11 质控要求及结果分析：正常细胞对照孔应该有完整的细胞单层，病毒对照孔应出现 CPE 变化， 原始浓度的阳性对照药物能够阻止 CPE 的产生。通过比较待检药物和阳性对照药物的 EC50 值，结合待 检药物的 SI 值，评估其体外抗病毒效果。 9 清场与消毒 9.1 操作结束后，及时清理生物安全柜内的物品，用 75 ％乙醇擦拭外表面后，移出生物安全 柜。 9.2 将实验过程产生的所有污染材料经 121 ℃，30 min 高压消毒灭菌处理。 9.3 用新鲜配制的有效氯 5500 mg/L 的含氯消毒液擦拭工作台面、生物安全柜内壁及台面，不 要擦拭顶棚，作用后用清水擦拭以除去残余消毒液，关闭生物安全柜，紫外灯消毒 30 min。 9.4 按照正确的脱