ICS 65.020.99 CCS B 62 重 DB50 庆 市 地 方 标 准 DB50/T 1148—2021 白掌种苗组培快繁技术规程 2021 - 11 - 01 发布 重庆市市场监督管理局 发 布 2022 - 02 - 01 实施 DB50/T 1148—2021 前  言 本文件按照GB/T 1.1―2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由重庆市农业农村委员会提出并归口。 本文件起草单位：重庆市农业科学院。 本文件主要起草人员：杨小艳、谢树章、王忠伟、韩垚、林清、吴红、王虹。 I DB50/T 1148—2021 白掌种苗组培快繁技术规程 1 范围 本文件规定了白掌种苗组培快繁的设施设备、操作流程等技术要求。 本文件适用于白掌种苗的生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 8321 农药合理使用准则 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 496 肥料合理使用准则 通则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 白掌 Spathiphyllum floribundum 又名白鹤芋、苞叶芋、银苞芋，为天南星科白鹤芋属多年生常绿草本花卉。 3.2 组培快繁 tissue culture and rapid propagation 从植物体分离出符合需要的器官或组织材料，通过无菌操作，在人工控制条件下进行离体培养，在 短时间内获得大量遗传性一致个体的方法。 3.3 外植体 explant 从自然生长的活体植物上获取的用于建立植物组培快繁体系的起始材料。 3.4 组培苗 plantlet 利用植物组织、器官或细胞等作为起始材料，通过植物组织培养方式生产获得的植株。 4 缩略语 1 DB50/T XX—XXXX 下列缩略语适用于本文件。 6-BA：6-苄基腺嘌呤（6-benzylaminopurine） IBA：吲哚丁酸（3-indole butyric acid） MS：一种常用基本培养基（Murashige 和 Skoog（1962）） NAA：萘乙酸（naphthyleneacetic acid） Tween-20：聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（Polyoxyethy-lene(20)Sorbaitan Monolaurate） 5 设施设备 5.1 设施要求 包括准备室、药品室、培养基配制室、灭菌室、洗涤室、更衣室、接种室、培养室、驯化室等，根 据生产工艺流程（生产流水线）有序排布。接种室和培养室应防潮、隔热保温、保持清洁，定期进行环 境消毒。周边环境应干燥、安静、通风透光、空气清新。 5.2 仪器设备要求 包括高压灭菌器、紫外灯、臭氧发生器、电子天平、pH 计、冰箱、微波炉、超净工作台、微量移 液器、接种器具（电热杀菌器）、石英玻璃珠、枪状镊子、手术刀柄刀片、切割碟子、温度计、光照培 养箱、培养架（包括日光灯）、调速振荡器、组培瓶、试管、盛装器皿（烧杯、试剂瓶等）、计量器皿 （量筒、容量瓶等）以及其他常用消耗品等。仪器设备应符合GB 19489的规定。 6 组培快繁操作流程 6.1 接种前准备 6.1.1 6.1.1.1 培养基配制和灭菌 培养基配制 芽诱导培养基：MS+1 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA +30 g/L 蔗糖+7 g/L 琼脂，pH值为5.6～5.8。 继代增殖培养基：MS+ 0.4 mg/L 6-BA +0.05 mg/L IBA +30 g/L 蔗糖+7 g/L 琼脂，pH值为5.6～ 5.8。 生根培养基：1/2 MS+0.05 mg/L IBA+30 g/L 蔗糖+7g/L 琼脂，pH值为5.6～5.8。 配制培养基用水应不低于GB/T 6682 规定的三级水。 6.1.1.2 培养基灭菌 培养基配制完后，分装至组培瓶中。121℃高压灭菌15 min～20 min，取出冷却备用。 6.1.2 超净工作台消毒 超净工作台（或洁净无菌接种室）提前30 min 打开紫外灯，灭杀菌30 min 后关掉紫外灯，然后开 机通风，打开接种用电热灭菌器，15 min～20 min 后人员才可进入室内。用75%酒精擦洗超净工作台台 面消毒。 6.1.3 2 接种人员准备 DB50/T 1148—2021 接种人员应在更衣室更换拖鞋、穿白大褂（或接种服），戴上帽子和口罩后进入接种室（或经过风 淋室后进入接种室），操作前和操作中经常用75%酒精棉球擦手。 6.2 外植体接种 6.2.1 外植体的选择 应选择长势健壮、叶色浓绿有光泽、花朵大、无病虫害的优良植株带侧芽的当年生茎段。 6.2.2 外植体的消毒灭菌处理 将选好的白掌侧芽茎段去除叶片后，用自来水冲洗干净，切除在外暴露的表皮，用75%酒精浸泡消 毒1 min，倒出酒精后，用无菌蒸馏水冲洗2 次，再用3%次氯酸钠溶液（现配现用、避光）加1滴～2滴 Tween-20 消毒15 min～20 min，并不断摇动。将次氯酸钠溶液倒出，用无菌蒸馏水冲洗5 次～6 次， 用无菌滤纸吸干水分。 6.2.3 接种器械灭菌 接种器械先用75%酒精擦拭，再放在酒精灯外焰上灼烤，时间≥10 s。若使用接种用电热灭菌器， 接种器械先用75%酒精擦拭，待电热灭菌器温度升至250 ℃～300 ℃，再插入接种用电热灭菌器中进行 灭菌，第一次灭菌3 min～4 min，以后每次使用灭菌≥15 s。 6.2.4 外植体接种 将侧芽茎段平放在无菌滤纸上，用解剖刀剥掉外层叶片后，切取顶端0.5 cm～0.8 cm的芽组织，接 种到芽诱导培养基中。接种时左手拿组培瓶，右手轻轻取下盖子，然后用镊子将材料送入瓶中，轻轻一 压，使外植体与培养基紧密接触，并使外植体在瓶内均匀分布。接种完毕立即盖上瓶盖并做好标记，注 明材料名称、接种日期、培养基类型、接种人等事项。 6.3 培养 6.3.1 芽诱导 外植体接种到芽诱导培养基后，将组培瓶整齐、均匀摆放在培养架上，温度25 ℃，光照强度2000 lx～3000 lx，光照12 h，黑暗12 h，诱导时间为40 d～60 d。培养期间定期观察材料生长情况，并作 好记载，如发现污染，应及时将污染瓶移出培养室，待高温灭菌后清洗或丢弃。 6.3.2 继代增殖快繁 6.3.2.1 提取母瓶 应仔细检查，剔除污染母瓶。 6.3.2.2 取苗 先打开组培瓶盖，瓶口不应斜向外，将取出的白掌丛生苗放于无菌的碟子上分苗。 6.3.2.3 切苗接种 用解剖刀将白掌丛生苗切割成单株小苗或小团块，每个小团块3 株～4 株小芽苗，将小苗或小团块 接种到继代增殖培养基中，宜接种6 株～8 株（团）/瓶。接种完毕后做好标记，注明材料名称、接种 3 DB50/T XX—XXXX 日期、培养基类型等事项。培养室温度为25 ℃，光照强度 2000 lx～3000 lx，光照12 h，黑暗12 h， 30 d 继代一次。 6.3.3 生根壮苗 从继代增殖瓶苗中提取母瓶，取苗放置于无菌的碟子上，分苗切取生长健壮、叶色正常、叶片舒展、 适于生根的幼苗接种到生根培养基中，宜接种10 株/瓶。接种完毕后做好标记，注明材料名称、接种日 期、培养基类型等事项。光照强度 2000 lx～3000 lx，光照12 h，黑暗12 h，30 d 后检查幼苗基部新 根生长情况。其它操作要求参照6.3.2。 6.4 组培苗炼苗与移栽管理 6.4.1 组培苗移栽要求 生根培养30 d 后，株高2.5 cm～5.0 cm；茎干粗壮，不徒长；叶数3 片～5 片，叶色翠绿，幼苗 基部长出3 条以上、长1 cm～3 cm 的新根，根系粗壮有活力。 6.4.2 炼苗 将生根后的瓶苗移出培养室放入驯化室松盖炼苗2 d 以上，炼苗时温度为20 ℃～28 ℃，空气湿度 为60%～80%，光照强度为3000 lx～5000 lx，保持环境洁净。 6.4.3 移栽基质准备 用粗细度0 mm～10 mm 泥炭加水搅拌预湿，相对含水量为55%～60%。 6.4.4 移栽 用镊子轻轻取出组培幼苗并洗净其根部培养基，用0.2% 多菌灵+0.1% 生根粉溶液浸泡2 min～5 min 后，种植至装有基质的50 孔穴盘（长宽28.5 cm×54 cm，孔径3 cm×3 cm）中，再用0.2%多菌灵+0.1% 生根粉溶液浇透基质。 6.4.5 移栽管理 用薄膜和遮阳率75%的遮阳网盖膜保湿遮光，空气湿度控制在75%～85%；14 d 后撤掉薄膜和遮阳网， 不应强光直晒，保持基质湿润，养护温度为25 ℃～28 ℃；当小苗有新根和新叶长出时开始施肥。选用 肥料应符合NY/T 496的规定，病虫害防治选用农药应符合GB/T 8321的规定。 6.5 种苗出圃 当种苗株高5 cm～8 cm，苗健壮挺拔，形态完整，叶数5 片～10 片，叶色浓绿有光泽，根系成团 时可出圃。 4