ICS 65.020.01 CCS B 05 黑 DB23 龙 江 省 地 方 标 准 DB23/T 3039—2021 灵芝液体菌种制备技术规程 2021-12-24 发布 黑龙江省市场监督管理局 2022-01-23 实施 发 布 DB23/T 3039—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由黑龙江省林业和草原局提出。 本文件起草单位：尚志市远成菌业有限公司、东北林业大学、哈尔滨学院、黑龙江省尚志国有林场 管理局老街基林场、黑龙江省尚志国有林场管理局、黑龙江省林业和草原局调查规划设计院。 本文件主要起草人：邹莉、许泽成、孙婷婷、韩金胜、蔡晓楼、王旭彤、耿楠楠、孙健、刘传龙、 曲晓磊、李亚伟、乌木提•巴合提别克、佟鑫宇。 I DB23/T 3039—2021 灵芝液体菌种制备技术规程 1 范围 本文件规定了灵芝（Ganoderma lucidum）液体菌种制备的环境卫生要求、生产仪器和设备、菌种 选择、制备母种、制备摇瓶液体种、液体种发酵罐空消、制备发酵罐液体种培养基、发酵罐液体种的接 种、发酵罐液体种培养条件、发酵罐液体种检测、发酵罐液体种质量要求、生产档案。 本文件适用于灵芝液体菌种制备。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 150.1 压力容器 第 1 部分：通用要求 GB/T 1921 工业蒸汽锅炉 参数系列 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 11165 实验室 pH 计 GB/T 13554 高效空气过滤器 GB 19153 容积式空气压缩机能效限定值及能效等级 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 环境卫生要求 4.1 生产环境 应符合 NY/T 528 的规定。 4.2 生产车间 应符合 GB 50073 的规定。 5 生产仪器和设备 液体种发酵罐应符合 GB/T 150.1 的规定，空气压缩机应符合 GB 19153 的规定，空气过滤器应符合 GB/T 13554 的规定，pH 计应符合 GB/T 11165 的规定，蒸汽锅炉应符合 GB/T 1921 的规定，高压蒸汽灭 菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、液体菌种接种枪、冰箱、显微镜、磅秤、天平应符 合 NY/T 528 的规定。 1 DB23/T 3039—2021 6 菌种选择 选择抗逆性强、抗杂菌能力强、菌丝生长健壮、产量高的菌种。 7 制备母种 7.1 母种培养基的制作 制作马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）或综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基（CPDA），装入试管（18 mm × 180 mm 或 20 mm × 200 mm）中，分装量宜为试管长度的 1/4，塞上棉塞，棉塞应使用梳棉。 将试管放入高压蒸汽灭菌锅中，在 0.105 Mpa～0.125 Mpa 下灭菌 30 min。灭菌后摆放成的斜面培养基 顶端应距棉塞底部≥20 mm。 7.2 接种与培养 在无菌条件下，用接种钩取黄豆粒大小的初始菌种接种在母种培养基上。母种培养的温度宜为28℃ ±1℃，空气相对湿度控制在40%～50%，通风、避光培养14 d～18 d。 8 制备摇瓶液体种 8.1 培养基配方 培养基配方：葡萄糖 20 g、玉米粉 10 g、酵母粉 5 g、蛋白胨 3 g、磷酸二氢钾 2 g、硫酸镁 1 g、 水 1000 mL。水的质量应符合 GB 5749 的规定。 8.2 培养基的制作、灭菌 将配方中的原料充分混合均匀，装入 500 mL 或 1000 mL、耐 126℃高温、无色或近无色的玻璃三角 瓶中，装液量宜为三角瓶体积的 1/4，用 16 cm × 16 cm 聚乙烯透气封瓶膜封口。在 0.105 Mpa～0.125 Mpa 下灭菌 30 min。 8.3 摇瓶液体种的制备 在无菌条件下，用接种铲将一管母种接入摇瓶液体种培养基中，置于恒温振荡培养箱，在 28℃以 180 r/min 振荡培养 9 d～12 d。当培养液澄清透明，菌丝球密集均匀悬浮于液体中不分层，即可获得 摇瓶液体种。 9 液体种发酵罐空消 液体种发酵罐初次使用，应检查发酵罐上全部阀门和压力表，进行空消。空消时罐内蒸汽压力应达 到 0.105 Mpa～0.125 Mpa、温度应达到 121℃～124℃灭菌 40 min。 10 制备发酵罐液体种培养基 10.1 培养基配方 在8.1配方的基础上加入2.9 mL/L的消泡油。 10.2 初始 pH 值 1 mol/L HCl 或 1 mol/L NaOH 调节 pH 值为 5.5～6.0。 2 DB23/T 3039—2021 10.3 投料与定容 将 10.1 中的原料按比例充分混合均匀，倒入液体种发酵罐中，加水定容至罐体总容积的 65%～70%， 拧紧上料口盖。 10.4 灭菌 液体种发酵罐内蒸汽压力应达到 0.105 Mpa～0.125 Mpa，温度应达到 121℃～124℃灭菌 40 min。 10.5 冷却 灭菌后将冷水通入发酵罐夹层或者内置冷却系统中循环，使培养基降温至 24℃～28℃。降温过程 中应及时向发酵罐内通入无菌风。 11 发酵罐液体种的接种 用带有手柄的内径略大于接种口的铁丝圈缠绕纱布，蘸上 95%的酒精，套在接种口上点燃。打开摇 瓶液体种封瓶膜，用火焰灼烧瓶口 30 s～40 s，打开接种口盖，将摇瓶液体种迅速倒入罐中，接种量 为发酵罐装液量体积的 8%。迅速盖好接种口，拧紧。 12 发酵罐液体种培养条件 12.1 通风量 3 每分钟宜通入无菌空气 1.25 m 。 12.2 罐压 应保持在 0.03 Mpa～0.05 Mpa。 12.3 培养温度 宜控制在 28℃±1℃。 12.4 培养时间 宜控制在 8 d～10 d。 13 发酵罐液体种检测 13.1 取样 接种 4 d 后进行检测，用酒精火焰灼烧取样阀 30 s～40 s，弃掉最初流出的少量液体种，取 30 mL～ 50 mL 液体种放入无菌 150 mL 三角瓶中，塞紧棉塞。取样后应用酒精火焰把取样阀烧干。 13.2 检测 对 13.1 所取样品在 PDA 平板培养基上画线培养，在 28℃±1℃下培养 2 d～3 d，每天观察菌落生 长情况，若 PDA 平板培养基上灵芝菌丝正常生长，没有杂菌污染，则表明菌种合格。 14 发酵罐液体种质量要求 14.1 感官指标 应符合表 1 的要求。 3 DB23/T 3039—2021 表 1 感官指标 项 目 指 标 菌液色泽 球状菌丝体呈乳白色，滤液呈黄棕色 菌液形态 菌液稍粘稠，有大量球状菌丝体悬浮、分布均匀、不迅速分层 菌液气味 有灵芝菌种培养时特有的香味，无异味，发酵罐排气口气味正常 14.2 理化指标 应符合表 2 的要求。 表 2 理化指标 项 目 标 pH 值 3.5~5.5 菌丝湿重（g／100 mL） ≥5 显微镜下菌丝形态 样品无菌检查 15 指 菌丝粗壮，有球状和丛状菌丝，分布均匀 有灵芝菌丝生长，无霉菌、酵母菌、细菌菌落生长 生产档案 应建立生产档案，内容包括：环境卫生要求、生产仪器和设备、菌种选择、制备母种、制备摇瓶液 体种、液体种发酵罐空消、制备发酵罐液体种培养基、发酵罐液体种的接种、发酵罐液体种培养条件、 发酵罐液体种检测、发酵罐液体种质量要求。 __________________ 4